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背景 据美国癌症协会2004年的统计，卵巢癌的估计五年生存率超过50％，与上世纪七、八十年代比较有了明显的提高。但多数患者在3年左右复发，并最终因癌症死亡，目前进展期EOC的治愈率仍仅为20-25％，因此为改善EOC长期生存有必要对导致低治愈率的原因进行探索。研究表明卵巢癌高复发率的原因之一是因为卵巢癌患者腹腔内普遍存在着免疫功能的异常，尤其是在化疗以后，并且与卵巢癌的预后直接相关。 巨噬细胞在先天性免疫防御和获得性免疫应答中有不可替代的重要地位，在机体的抗肿瘤免疫中起了重要的作用。激活的巨噬细胞通过吞噬作用，细胞毒作用，生物活性物质的分泌以及抗原提呈作用等发挥抗肿瘤作用。然而已有研究表明卵巢癌患者腹腔及肿瘤组织局部的巨噬细胞表现出明显的抗肿瘤功能缺陷。主要表现为细胞毒作用明显低下；吞噬功能明显下降；细胞因子分泌紊乱，促炎因子分泌量少，如TNF、IL-1，而炎症抑制因子则多量分泌如TGF-β、IL-10等，而且血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等促进肿瘤新生血管生成的细胞因子分泌较多。 卵巢癌腹腔及局部巨噬细胞功能异常的原因主要涉及肿瘤细胞分泌的生物活性物质如TGF、IL-10等，缺氧的局部环境，化疗药物及营养、精神状况的影响。因为巨噬细胞是死亡细胞的主要清除者，近年的研究发现细胞的死亡形式对巨噬 浙江大学硕士学位论文细胞的功能也有着重要的影响。在一些慢性炎症性疾病及一些血液系统肿瘤的研究中发现不同死亡形式的死亡细胞对巨噬细胞功能会产生不同的影响。多项研究表明凋亡细胞能够促进巨噬细胞免疫抑制因子分泌，从而抑制促炎因子的分泌，并下调巨噬细胞的抗原提呈能力。而坏死细胞的作用则相反。在恶性肿瘤中相关的研究较少，主要集中在血液系统肿瘤和少部分实体肿瘤中如结直肠癌，黑色素瘤，肾癌等，但研究结果并不一致。多数研究支持凋亡细胞抑制巨噬细胞的抗肿瘤活性，但也有部分研究提示凋亡的肿瘤细胞能激活巨噬细胞的抗肿瘤活性。在卵巢癌中则还未见相关研究。 卵巢癌的主要辅助治疗手段化疗以诱导肿瘤细胞的凋亡作为治疗的终点。同时快速增长肿瘤组织局部的缺血缺氧环境，以及机体免疫系统对肿瘤组织的攻击，使卵巢癌患者肿瘤组织局部及腹腔内存在多量凋亡的肿瘤细胞。因此我们有兴趣对这些凋亡的卵巢癌细胞对巨噬细胞的功能产生的影响及影响机制进行研究，以探索不同死亡形式的卵巢癌细胞对免疫功能影响的临床意义。本研究以紫外线诱导凋亡的SKOV3细胞及冻融诱导坏死的SKOV3细胞作用于活化的巨噬细胞，来探讨在体外不同死亡形式的卵巢癌细胞对巨噬细胞功能的影响及可能的机制。材料与方法 以卵巢癌细胞株SKOV3与外周血单核细胞来源的巨噬细胞为研究对象。SKOV3细胞株来源于美国菌种保藏中心(ATcC)，巨噬细胞则从健康妇女外周血中分离出单核细胞经体外培养而成。以紫外线诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡，反复融冻诱导SKOV3细胞坏死，将凋亡和坏死SKOV3细胞分别与LPS活化的巨噬细胞共同培养后，以荧光染色法检测巨噬细胞对凋亡及坏死的SKOV3细胞的吞噬能力，Griess法检测混合培养后培养液上清中NO的浓度，MTT法检测巨噬细胞的细胞毒作用以及免疫细胞化学方法检测巨噬细胞CD80和CD86的表达，以探讨不同死亡形式的卵巢癌细胞对巨噬细胞的功能影响。以薄膜一超声法制备含磷脂酞丝氨酸(Ps)脂质体及磷脂酞胆碱(PC)脂质体，将PS脂质体和PC脂质体分别作用于LPS活化的巨噬细胞，检测巨噬细胞NO的分泌，细胞毒作用及CD80和CD86的浙江大学硕士学位论文表达，以探讨PS在凋亡细胞对巨噬细胞功能影响中的作用。各组实验均重复14次。各组数据进行正态分布检验及方差齐性检验，若符合正态分布和方差齐则采用方差分析方法检验，若为非正态分布，采用非参数检验。检测水准定为双侧Q== 0.05。统计软件采用SPSSll.oforwindows。结果第一部分不同死亡形式的卵巢癌细胞对巨噬细胞功能的影响:目的:探讨不同死亡形式的SKOV3细胞对巨噬细胞抗肿瘤功能的影响。结果:1.巨噬细胞对不同死亡形式卵巢癌细胞SKOV3的吞噬能力 巨噬细胞对凋亡的卵巢癌细胞SKOV3的吞噬率为35.3士6.9%，对坏死的卵巢癌细胞SKOV3的吞噬率为31 .2士4.1%。活化巨噬细胞对凋亡的SKOV细胞和对坏死的SKOV3细胞吞噬能力无显著差异( F=0.779，尸二0.418)。2.不同死亡形式的SKOV3细胞对巨噬细胞细胞毒作用的影响 以未加死亡细胞和脂质体的巨噬细胞为对照组，LPS激活的巨噬细胞对靶细胞的杀伤率为0.25士0.08。与凋亡的SKOV3细胞共同培养后，LPS激活的巨噬细胞对靶细胞的杀伤率为0.10士0.05，与对照组相比显著减弱(T=一0.145，尸=0.000);而与坏死的SKOV3细胞共同培养后，巨噬细胞对靶细胞杀伤率为0.36士0.09，与对照相t匕显著增强(T=o.1 12，尸=0.001)。3.不同死亡形式的SKOV3细胞对巨噬细胞NO产生的影响 以未加死亡细胞和脂质体的巨噬细胞为对照组?