心肌损伤坏死后的理想修复是通过激活内源心肌细胞的增殖或外来心肌细胞的补充，但是哺乳类动物成熟的心肌细胞几乎不存在分化增殖的能力，而且外来补充心肌细胞或干细胞难以存活和增殖。因此，心肌损伤坏死后不能得到有效的再生修复，这最终导致心脏功能的丢失。新近的研究显示，哺乳类动物存在一定的心肌细胞自身增殖能力，但这种能力在成年后的心脏损伤修复中极为有限，只有完全掌握心脏再生调控过程并进行一定诱导才能使心肌细胞进行有效增殖，进而达到修复受损心脏的目的。2002年，Poss等人最先发现成年斑马鱼具有心脏再生功能。在实验过程中，切除成年斑马鱼心室的20%后，发现斑马鱼心脏的损伤部位逐渐由增殖的心肌细胞替代瘢痕组织，最终能在1~2月后达到心脏的完全再生。一时间，斑马鱼心脏再生成为心血管领域研究的热点。目前虽不断有研究阐明这一过程的相关机制和影响再生的调控因素，但其中主要的调控机制仍不明确。最近，随着基因芯片技术的日趋成熟，有学者发现了心脏损伤后再生不同时间周围区域基因的差异表达，包括多条信号通路以及与细胞运动、炎症反应、细胞粘附等相关的多个基因，其中PDGF-B在心脏再生过程中表达上调，PDGF-B同源二聚体会刺激原代培养的斑马鱼心肌细胞DNA的合成，PDGF-B受体抑制剂会引起体内再生心脏以及体外原代培养的心肌细胞中DNA合成速度下降。结合已有文献资料，PDGF-B信号通路对于心脏再生过程中心肌细胞的增殖是必需的，但目前其调控信号通路尚需进一步研究和完善。近期研究显示，microRNA(miRNA)在调节与细胞损伤坏死、凋亡、分化、增殖等相关生理病理过程中发挥关键作用。在斑马鱼鳍再生的研究中，有学者通过对比鳍损伤前、再生活跃期和再生完全期三个阶段的miRNA表达差异变化，并通过在尾鳍局部注射特定miRNA类似物和拮抗剂的方法，发现miR-203通过抑制Lef1、miR-133通过抑制Fgf来调控斑马鱼鳍部分切除后的再生。基于此，通过PDGF-B信号通路找寻上游调控关键miRNA，并证明其在斑马鱼心脏再生中的调控作用，这将进一步深入揭示斑马鱼心脏再生的调控机制，丰富心脏再生理论，为人为干预激活内源性心肌细胞进行增殖修复提供新的靶点。因此，本课题组在已有斑马鱼平台的基础上成功建立了斑马鱼心脏再生模型；通过构建斑马鱼心脏的miRNA克隆文库，探索斑马鱼心脏miRNA表达谱；通过生物信息学预测可能靶向PDGF-B的miRNA；通过检测损伤后修复的多个时间点这些miRNA表达水平的变化，发现斑马鱼心脏再生中调控PDGF-B的关键miRNA；通过在原代分离的斑马鱼心肌细胞上干预特定miRNA的水平确定其对斑马鱼心肌细胞的增殖能力的影响。该发现将为在哺乳类动物中激活内源性心肌细胞增殖修复提供分子理论基础和干预方向。第一部分建立斑马鱼心脏再生模型目的：建立稳定、可靠的斑马鱼心脏再生研究平台。方法：1、将成年斑马鱼（6个月龄以上）麻醉后倒置在模具内，显微镜下分离、暴露斑马鱼心脏，在心室尖部位切除部分心室，放回水箱内进行正常喂养；2、通过切除面积的改变观察斑马鱼心脏部分切除后的死亡率变化；3、在心脏部分切除后的第7d、14d和30d取出心脏进行切片观察其再生修复情况；4、根据斑马鱼鱼龄，将野生型斑马鱼同一鱼系不同时期培育出的鱼分成0.5-1年龄鱼、1-2年龄鱼和大于2年龄鱼三组，在同一条件、同一切除面积（20%）下，进行切除后存活率和心脏修复能力的比较。结果：1、斑马鱼心脏部分切除后具有较高的存活率，在切除斑马鱼心脏面积小于20%情况下，其存活率达到70%以上，而切除面积在大于25%时，斑马鱼手术后存活率明显下降，为40%±7.1%。2、切片观察到在斑马鱼整个心脏再生过程中局部纤维组织逐渐减少，而增殖的心肌细胞不断增多，术后30天已基本达到再生修复；3、与1-2年鱼龄组相比，0.5-1年鱼龄和大于2年鱼龄组存活率下降（P<0.01），但是通过对术后7天和14天缺损面积的测算，发现三组鱼龄的斑马鱼心脏再生能力之间没有显著差异（P>0.05）。结论：斑马鱼心脏再生模型的建立具有较高的成功率和稳定性，成年斑马鱼随着切除面积的增大死亡率逐渐升高，切除面积在15%-20%之间是较为理想的建模范围，高龄斑马鱼仍存在心脏再生，但耐受手术的能力下降。第二部分靶向PDGF-B的miRNA在斑马鱼心脏再生中的表达谱分析目的：筛选靶向PDGF-B的心脏相对高表达的miRNA，且在斑马鱼心脏再生过程中变化明显的miRNA作为心脏再生机制研究的对象。方法：1、按前面步骤行斑马鱼心脏部分切除，常规方法提取手术后和正常斑马鱼心脏的蛋白质和RNA，并进行浓度测定和质量鉴定；2、通过WesternBlot和定量PCR在蛋白质和mRNA水平检测斑马鱼心脏再生过程中PDGF-B的表达；3、构建斑马鱼心脏miRNA克隆文库；4、利用生物信息学软件分析PDGF-B基因的3’非翻译区序列；5、根据3、4步骤结果筛选出结合PDGF-B位点又在斑马鱼心脏高表达的miRNA，定量PCR检测筛选出在斑马鱼心脏再生过程中表达明显下调的miRNA。结果：1、通过qRT-PCR技术和Western Blot技术检测PDGF-B基因水平和蛋白水平的表达，结果发现PDGF-B基因在心脏切除术后3d、7d和14d表达水平明显升高（P<0.01），其中7dpa表达水平最高；2、利用斑马鱼心脏miRNA克隆文库检测到miR-1、miR-133a、let-7f等在斑马鱼心脏中呈高表达；3、对斑马鱼心脏高表达的miRNA保守性的分析发现大部分miRNA在斑马鱼、小鼠和人的种属间具有高度的保守性，如miR-92b、miR-1、miR-133a等；4、通过对PDGF-B基因的3’非翻译区序列分析，发现PDGF-B基因的3’非翻译区上存在众多miRNA的结合位点，而且这些miRNA的结合位点在进化上都具有高度保守性；5、通过定量PCR检测发现miR-199、miR-92b、miR-143等在斑马鱼心脏再生过程中存在明显变化；6、与假手术比较，miR-92b在心脏损伤术后3d、7d、14d的表达水平降低，具有统计学意义（P<0.05），7dpa时表达水平最低，随后开始升高，在30dpa时，心脏中miR-92b恢复到正常水平。结论：通过对在斑马鱼心脏再生过程中变化明显的、靶向PDGF-B的心脏高表达miRNA进行筛选，确定miR-92b作为调控斑马鱼心脏再生的研究对象。第三部分miR-92b对斑马鱼心肌细胞增殖的作用和机制目的：确定miR-92b对斑马鱼心肌细胞增殖的影响，及在斑马鱼心脏再生中的调控机制。方法：1、培养293T工具细胞，分离、培养斑马鱼原代心肌细胞；2、Mirbase获得miRNAs成熟序列，设计其反义互补RNA，化学合成该序列，并进行碱基的2’甲氧修饰。将反义序列按照40nM浓度转染心肌细胞，孵育48小时，通过定量PCR分析其对靶miRNA的沉默效率；3、双荧光素酶报告基因系统预测miR-92b的靶基因；4、利用生物信息学软件分析PDGF-B基因的3’非翻译区序列中四个结合位点与miR-92b的亲和力；5、定量PCR和Western Blot检测miR-92b inhibitor转染后的心肌细胞PDGF-B的表达量；6、通过免疫荧光检测MEF-2、PCNA观察心肌细胞miR-92b inhibitor转染后的增殖能力变化。结果：1、293T工具细胞转染miR-92b mimic24h后，细胞中miR-92b的水平明显提高，是对照组的22倍。转染inhibitor24h后，细胞中miR-92b的水平显著降低，降至对照组的41.0%；2、生物信息学分析显示miR-92b的种子序列与PDGF-B均有7-8个碱基的配对，具有很高的亲和力；3、通过双荧光素酶报告基因系统预测PDGF-B是miR-92b的靶基因；4、分离的斑马鱼心肌细胞转染miR-92b inhibitor48h后，miR-92b的水平降为对照组的48.1%，总细胞数目约为对照组的2倍。PCNA的免疫荧光结果发现，转染组中显示每高倍镜下PCNA阳性的细胞数目明显增多，是对照组的1.6倍；5、Western Blot和QRT-PCR检测转染miR-92b inhibitor的心肌细胞PDGF-B的表达，结果显示转染miR-92binhibitor48h后，PDGF-B的mRNA和蛋白表达水平都较对照组明显升高（P<0.05）。结论：miR-92b可能通过PDGF-B调控心肌细胞增殖。总结：斑马鱼心脏再生模型的建立具有较高的成功率和稳定性，切除面积在15%-20%之间是较为理想的建模范围，高龄斑马鱼仍具有心脏再生能力；生物信息学预测可能靶向调控PDGF-B表达的miRNA进行筛选，以小RNA文库的方法确认了斑马鱼心脏组织中高表达的miRNA（miR-1、miR-133、miR-199、miR-21、miR-92等），并对这些miRNA在心脏再生过程中的表达水平进行实时定量PCR的检测，结果显示miR-92b可能是PDGF-B上游的关键调控基因；利用荧光素酶报告基因确认PDGF-B是miR-92b的靶基因，通过对培养的斑马鱼心肌细胞进行miR-92b的干预，发现降低miR-92b促进斑马鱼心肌细胞的增殖。本研究发现并证明了miR-92b通过其靶基因PDGF-B调控斑马鱼心脏再生的信号通路，丰富了心脏再生的分子调控机制。