第一部分妊娠水平的雌、孕激素对机体免疫系统的影响及机制研究目的探讨妊娠浓度雌、孕激素对小鼠体内调节性T细胞的影响及可能机制。方法实验分为体内部分和体外部分。体内实验：建立去势C57BL／6小鼠模型,两周后分别予以皮下注射雌激素(E2)、孕激素(P4)、雌孕激素联合及溶剂(生理盐水)模拟重建妊娠浓度小鼠激素水平。维持两周后,流式细胞术和免疫组化检测给药后小鼠外周血、脾脏、腹腔淋巴结、胸腺中调节性T细胞(Treg)比例变化情况。并通过ELISA的方法检测外周血中TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β等细胞因子水平的变化。体外实验：通过CFSE标记磁珠分选的调节性T细胞反应细胞,外加E2和共刺激信号,观察标记的调节性T细胞是否发生增殖,并进一步通过CFSE标记法结合单向混合淋巴细胞培养来验证其调节性T细胞的功能。结果体内实验：无论雌、雄小鼠,去势后单独的妊娠水平的E2即可明显提高外周血、脾脏、腹腔淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞的比例(分别为6.13±1.32%；10.50±1.85%；7.63±1.68%),与溶剂组相比有明显统计学差异(P<0.05)。但在胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例与溶剂组没有统计学差异。与此同时,单独的妊娠水平的P4相比于溶剂组,Treg比例有所升高,但不具有统计学意义(P>0.05)。而联合应用雌、孕激素对Treg的影响与单独应用E2的结果类似,两者没有统计学差异(P>0.05)。相同干预药物,Treg的比例变化在雌雄两组之间没有差异(P>0.05)。同样的结果在免疫组化中得到验证。对于外周血中细胞因子的影响,在没有外来抗原刺激的条件下是没有多大影响的。体外实验：单独的E2处理对于调节性T细胞并不能直接诱导CFSE标记的调节性T细胞的增殖(PI=1.01±0.01),单独的TCR双信号刺激也不能检测到CFSE的增殖(PI=1.03±0.02),只有在E2的预处理联合CD3/CD28的刺激下才能检测到调节性T细胞自身的增殖(PI=1.15±0.03)。验证了E2对于调节性T细胞数量上的促增殖作用之后,功能学方面的实验结果提示,CD3／CD28的刺激能显著促进CD4+CD25- NaiveT细胞的增殖(PI=1.56±0.03),在此基础上按照反应细胞与调节性T细胞比为1：1,未经E2处理组也能检测到对刺激后增殖的抑制(PI=1.18±0.04),E2的预处理能进一步增强调节性T细胞的抑制功能(PI=1.07±0.02),不仅与刺激组相比有差异(1.07±0.02 vs 1.56±0.03,P<0.05),与未经E2处理组同样有差异(1.07±0.02 vs 1.18±0.04,P<0.05)证明了E2不仅能通过促进调节性T细胞的增殖而扩增,而且在功能上也能进一步增强其对效应T细胞活化后增殖的抑制效应。结论单独应用妊娠浓度E2可明显提高小鼠外周血,脾脏,腹腔淋巴结CD4+CD25+Foxp3+Treg比例,妊娠浓度的P4对外周Treg没有影响，两种激素对中枢淋巴器官的淋巴细胞均没有影响。这可能与小鼠T淋巴细胞中雌、孕激素的受体分布、功能及与性别遗传没有相关性有关。体外实验的结果不仅验证妊娠水平的E2通过改变调节性T细胞的无反应性,在联合TCR信号下能促进调节性T细胞自身发生增殖,还能在功能上加强调节性T细胞的抑制作用。无论是中枢还是外周的调节性T细胞的比例均没有影响.妊娠水平的雌、孕激素对于血清中细胞因子免疫网络是没有太大的影响。第二部分调节性T细胞在妊娠保护中的作用及抗原特异性的研究目的：探讨妊娠中调节性T细胞的免疫调节作用是否具有抗原特异性。方法：本实验分体外部分和体内部分。体外实验：以雌性CBA/J与雄性DBA/2J同笼构建流产趋势模型,从流产趋势孕10天雌鼠脾脏分离的单个核细胞经尼龙毛处理后作为效应T细胞(Tef)；DBA雄鼠脾细胞经MMC处理后作为APC；根据培养体系中调节性T细胞(Treg)的来源分组：未孕CBA雌鼠来源的Treg为未孕组,正常妊娠(CBA/J×Balb/c)来源的Treg为正常妊娠组,无关正常妊娠(Balb/c×C57BL/6)来源的Treg为正常妊娠无关对照组。按照Tef与Treg比分别为10：1,1：1,1：5构建单向混合淋巴细胞培养体系,72小时后,流式细胞仪检测标记细胞的增殖指数(Proliferative Index, PI), ELISA检测细胞因子水平。体内实验：构建流产趋势的妊娠模型,于妊娠第0-2天,过继输注来自正常妊娠组、未孕组、无关妊娠对照组的CD4+CD25+Treg,观察Treg的过继输注对妊娠结局的影响。按照Treg的来源不同分为：正常妊娠组、未孕组、无关妊娠对照组。结果：体外实验：在Tef与Treg比例为10：1的体系中,未孕组效应性T细胞增殖明显受到抑制。在1：1,1：5的体系中同样均能检测到明显的抑制效应,但这种抑制效应没有剂量依赖性。而分别来自于其他两组正常妊娠小鼠的Treg也表现出相似的增殖抑制效应,各组之间没有统计学差异。在Treg的干预后培养体系中细胞因子水平的变化在Treg的干预后,IL-10的水平明显升高,并且这种水平的升高呈Treg剂量依赖性正相关。而IFN-γ的水平明显减少,并且与Treg剂量呈负相关。体内实验：在外周血中,流产趋势组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例较未孕组明显增高(6.59% vs 3.55%,P<0.05)；正常妊娠组中外周血能检测到更为显著的Treg的升高,不仅与未孕组有差异(8.34% vs 3.55%,P<0.05),与流产趋势组亦有明显差异(8.34% vs 6.59%,P<0.05)。同样,在淋巴结(6.86% vs 4.85；9.62%vs 4.85%, P<0.05; 9.62% vs 6.86%, P<0.05)中也获得相似结果。过继输注后,只有来自正常妊娠组小鼠的Treg的过继输注才能完全阻止流产的发生。而来自未孕组和无关对照组的Treg不能逆转流产的发生。Treg过继输注不能改变体内Th1型细胞因子水平,但是能显著提升IL-10水平。结论：无论哪种来源的Treg都具有免疫调节的潜能。在体外均能检测到对Treg增殖的抑制效应,但并没有表现出抗原特异性的更为显著抑制功能；Treg在体外可能是通过分泌高浓度的IL-10发挥抑制效应。但在体内正常的妊娠过程中产生的Treg在保护胚胎免受母体攻击方面是具有抗原特异性的,只有之前接触胎儿父系抗原的具有抗原特异性的Treg才能在体内发挥对胎儿的保护作用。第三部分妊娠水平的雌、孕激素在H-Y皮肤移植中的作用及其机制研究目的探讨妊娠浓度雌激素(E2)、孕激素(P4)对小鼠H-Y皮肤移植的影响及其机制。方法建立小鼠去势模型,每日分别注射E2、P4及E2+P4联合注射,14d后受鼠行H-Y皮肤移植并继续给药。检测移植前及移植后第3天外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)变化及外周血细胞因子水平；观察H-Y皮肤移植物的存活。结果E2可提高外周血Treg的比例(6.13±1.32% vs 3.26±0.68%,P<0.05),移植后Treg的比例进一步升高(11.78±2.32% vs 3.33±0.57%,P<0.05)；P4对Treg没有显著影响(4.01±0.79% vs 3.26±0.68%,P>0.05),而移植前后E2+P4联合对Treg的影响与单独应用E2结果相似(6.13±1.32% vs 7.25±1.71%,P>0.05;12.35±3.04% vs 11.78±2.32%,P>0.05)。移植后P4对Treg仍无明显影响,而E2+P4联合亦不能进一步提高Treg的比例。细胞因子检测显示,E2、P4均能减少促炎因子分泌,并提高抗炎因子分泌(P<0.05)。E2、P4均能有效延长H-Y皮肤移植物存活((44.0±1.2天,35.5±0.8天,23.0±1.6天,P<0.05,P<0.05),且两者联用具有协同效应(MST=56.5±3.2天)。结论P4可通过诱导细胞因子免疫偏移促进H-Y皮肤移植物的存活。而E2除诱导细胞因子免疫偏移外,还通过提高Treg水平而延长移植物的存活。