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铁(Fe)是植物生长所必需的微量营养元素,在植物中,光合作用、呼吸作用、生物合成等代谢活动都需要Fe的参与,Fe的缺乏会影响植物的生长发育。NRAMP家族蛋白在金属离子的吸收和转运中发挥着重要作用,但是很多NRAMP蛋白的功能尚不清楚,本论文对拟南芥中NRAMP家族成员AtNRAMP6的功能进行研究,发现在缺铁条件下,AtNRAMP6对拟南芥侧根的发育有重要作用。具体研究结果如下:qRT-PCR以及ProNRAMP6:GUS组织化学染色显示AtNRAMP6主要表达在侧根,嫩叶以及花柱中。用不同浓度的Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+处理拟南芥后分析AtNRAMP6的表达量,发现AtNRAMP6的表达并不受这些离子的诱导。将GFP连接到AtNRAMP6的C端构建AtNRAMP6-GFP融合表达的亚细胞定位载体,用PEG或者农杆菌介导的方法分别转化到拟南芥叶肉细胞原生质体和烟草叶片细胞中进行瞬时表达,发现AtNRAMP6定位在高尔基体(Golgi)及反面高尔基体网状结构(TGN)中。利用T-DNA插入突变体及AtNRAMP6过表达拟南芥植株研究AtNRAMP6的生理功能,发现在缺铁条件下,突变体的侧根长度比野生型的短,但主根长度没有显著差异,地上部分的长势也比野生型的差。测量不同组织中离子含量发现突变体和野生型各组织中Fe含量并没有显著差异。同样在缺铁条件下,AtNRAMP6过表达植株比野生型生长得更好,但过表达植株各组织中的Fe含量相对于野生型并没有发生变化。将AtNRAMP6在铁吸收缺陷型酵母突变株Δfet3fet4和铁敏感型酵母突变株Δccc1中表达,发现在缺铁时AtNRAMP6并不能回补fet3fet4的表型,但在铁毒害条件下,AtNRAMP6的表达会使Δ ccc1对铁毒害更敏感。这些结果说明,AtNRAMP6是在细胞内转运离子,并不参与铁离子的吸收。在缺铁情况下,AtNRAMP6参与到细胞内铁离子的利用,可能通过将Golgi/TGN中的铁分配到细胞内其他结构来维持细胞内代谢活动的进行,对拟南芥的生长特别是侧根的发育有重要作用。很多NRAMP家族蛋白被发现能同时转运多种金属离子,离子选择性较低。AtNRAMP3已经被鉴定能同时转运Fe、Mn、Cd离子,但是该转运蛋白结合和选择离子的分子机制并不清楚,本论文利用氨基酸定点突变的方法来筛选和鉴定AtNRAMP3结构中对离子转运和离子选择性的关键氨基酸残基,阐述AtNRAMP3结构与功能之间的关系。具体研究结果如下:对AtNRAMP3的结构与功能研究发现,氨基酸D72,N75和M248在原核生物和真核生物的NRAMP蛋白中都非常保守,根据细菌中同源蛋白ScaDMT和EcoDMT的晶体结构显示,这三个位点是组成离子结合位点的氨基酸。我们发现D72A和N75A突变体严重损害了转运Fe2+和Mn2+的能力,说明这两个氨基酸对AtNRAMP3转运Fe2+和Mn2+是必须的,而M248A严重降低了 Cd2+的转运活性但保留了部分Fe2+和Mn2+的转运能力,M248S丧失了 Fe2+和Mn2+的转运活性但Cd2+转运能力几乎不受影响,M248D和M248C降低了 Fe2+和Cd2+的转运能力但失去了 Mn2+转运活性,M248I降低了 Fe2+、Mn2+和Cd2+的转运活性,这些结果说明M248可能与AtNRAMP3的离子选择性有关。E194A和R262A丧失了 Fe2+和Mn2+的转运活性,在模拟结构中,酸性氨基酸E194位于TM5的C端,碱性氨基酸R262位于TM6b的C端,这两个保守的氨基酸的侧链面对面靠近,我们推测这两个氨基酸可能对维持蛋白结构的稳定起重要作用。G171A丧失了转运Fe2+的能力但不影响Mn2+和Cd2+的转运活性,这个氨基酸可能参与到离子的选择性。剪切掉N端会使AtNRAMP3丧失Fe2+和Mn2+的转运能力,而剪掉C端并不影响AtNRAMP3的功能,说明N端对AtNRAMP3行使功能有重要作用。这些结果说明,AtNRAMP3的离子转运活性和离子选择性与结构中的一些关键氨基酸残基息息相关。