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与普通材料相比,纳米材料理化性质独特,应用也十分广泛,在社会生产生活的许多方面都有纳米材料的身影。与其他纳米材料相比,纳米银还具有优越的抗菌、抗病毒性能,成为应用最多的金属纳米材料之一。纳米银主要经消化道、呼吸道和皮肤进入人体,可对人体多个器官系统造成损伤,威胁人类健康。纳米银材料的理化性质对其生物活性有重要影响,如粒径大小、材料形状和表面修饰等。多项研究结果表明纳米银可经多种途径进入脑内,破坏血脑屏障、损伤神经元和神经胶质细胞,产生神经毒性。模式生物秀丽线虫虽身体结构简单,但具有完整的神经系统,在神经毒性研究中具有独特优势。现有实验证据表明重金属镍、纳米聚苯乙烯、多种碳基纳米材料等会通过损伤相关神经元对秀丽线虫产生神经毒性,然而目前关于纳米银暴露对秀丽线虫神经元发育和神经递质受体的影响尚未明确,相关方面的研究还很欠缺。
本研究将两种具有不同表面性质的纳米银(20 nm PVP-AgNPs、20 nm AgNPs)分别暴露于模式生物秀丽隐杆线虫,研究低浓度(0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L)和较长期暴露(延长暴露48 h和慢性暴露6 d)条件下,两种纳米银对秀丽隐杆线虫的神经毒性作用,探讨纳米银引起的神经毒性与神经元和神经递质受体的关系以及不同包被对纳米银神经毒性的影响,进而初步探讨纳米银产生神经毒性的机制。
1、纳米银的表征和暴露后线虫体内银含量检测:表征结果显示,20 nm PVP-AgNPs、20 nm AgNPs两种纳米银的粒径分别为22.08 nm和20.14 nm;在超纯水中的水合粒径大小分别为52.29 nm和450.8 nm;Zeta电位分别为-16.78 mV和-1.89 mV。20 nm PVP-AgNPs团聚少、分散性好,20 nm AgNPs团聚多,分散性差,两种纳米银均呈球形颗粒。将野生型秀丽线虫(N2)分别暴露于0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L的20 nm PVP-AgNPs或20 nm AgNPs 48 h和6 d,用石墨炉原子吸收光谱法对线虫体内银含量进行检测,结果表明两种纳米银在相同暴露剂量下,暴露时间延长至6d后线虫体内银含量均明显高于暴露48 h,提示纳米银可在秀丽线虫体内蓄积。相同暴露条件下,20 nm PVP-AgNPs 各组线虫体内的银含量显著高于20 nm AgNPs组,表明PVP包被使纳米银分散性增强,更易进入线虫体内,产生蓄积。
2、纳米银对秀丽线虫的一般毒性效应研究:将 L1 期秀丽线虫分别暴露于两种纳米银后,对线虫的寿命、体长和体宽进行测量。暴露 48 h 后,20 nm PVP-AgNPs和20 nm AgNPs的1 mg/L、10 mg/L组线虫相对平均寿命分别降为对照组的87.52%、79.91%和94.18%、86.72%。暴露6 d后,20 nm PVP-AgNPs和20 nm AgNPs的0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L组线虫相对平均寿命分别降为对照组的88.28 %、76.74%、70.65%和93.05%、81.63%、72.38%。两种纳米银暴露均会使秀丽线虫最长寿命和相对平均寿命减小,并且暴露时间越长,损伤作用越大。体长体宽测量结果表明,与对照组相比,暴露48 h后,20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组及20 nm AgNPs的10 mg/L组线虫体长减小、体宽增大;暴露6 d后,20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组线虫体长减小、体宽增大,0.1 mg/L组线虫体宽增大,20 nm AgNPs的10 mg/L组线虫体长减小,体宽增大,1 mg/L 组线虫体宽增大。以上结果显示纳米银暴露对线虫体长和体宽的影响趋势并不一致,随着暴露剂量的增加,两种纳米银均会使秀丽线虫体长减小,体宽增大。总体来说,两种纳米银对线虫寿命和生长发育的毒性损伤作用大小为:20 nm PVP-AgNPs>20 nm AgNPs。
3、纳米银对秀丽线虫神经毒性效应研究:对纳米银暴露后线虫的运动行为、摄食排便行为、学习记忆行为进行观察检测。与对照组相比,暴露48 h后,20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组及20 nm AgNPs的10 mg/L组线虫头部摆动频率降低、排便运动周期变长、线虫化学趋向性系数(CI)降低、IT曲线下降;两种纳米银的10 mg/L组线虫身体弯曲频率和咽泵运动频率均降低。暴露6 d后,与对照组相比,两种纳米银的1 mg/L和10 mg/L组线虫头部摆动频率、身体弯曲频率和咽泵运动频率均降低、排便运动周期变长、CI显著降低、IT曲线下降,此外,20 nm PVP-AgNPs的0.1 mg/L组线虫排便运动周期也开始变长。以上研究表明纳米银暴露对线虫产生神经毒性,影响线虫局部运动、摄食和排便以及学习记忆等多种神经活动,暴露时间越长,毒性作用越大。两种纳米银的神经毒性20 nm PVP-AgNPs>20 nm AgNPs。
4、纳米银对秀丽线虫神经元和神经递质受体的影响:将转基因线虫BZ555、EG1285、DA1240和LX929分别暴露于两种纳米银后对线虫体内的荧光强度进行检测。相对荧光强度统计分析结果显示:纳米银暴露48 h后,与对照组相比, BZ555 线虫两种纳米银的 10 mg/L 组相对荧光强度降低;EG1285 线虫 20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L组和10 mg/L组相对荧光强度均降低,20 nm AgNPs仅10 mg/L组相对荧光强度降低;LX929线虫20 nm PVP-AgNPs的10 mg/L组线虫相对荧光强度降低,其他剂量组和20 nm AgNPs各剂量组相对荧光强度均无明显变化;DA1240线虫各暴露组相对荧光强度均无明显变化。暴露6 d后,与对照组相比,BZ555线虫20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组和20 nm AgNPs的10 mg/L组相对荧光强度降低;EG1285线虫两种纳米银的1 mg/L和10 mg/L组相对荧光强度均降低;LX929线虫20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组和20 nm AgNPs的10 mg/L组相对荧光强度降低;DA1240线虫各组相对荧光强度均无明显变化。进一步对纳米银暴露后线虫体内γ-氨基丁酸和多巴胺受体基因的表达量进行检查的,结果显示,线虫延长暴露于0.01 mg/L和0.1 mg/L的20 nm PVP-AgNPs后,与对照组相比,gab-1、ggr-1、dop-1基因表达量上调,1 mg/L组线虫ggr-2基因表达量下调,10 mg/L组线虫ggr-2、ggr-3和dop-3基因表达量下调;暴露于20 nm AgNPs后除0.01 mg/L和0.1 mg/L组线虫dop-1基因表达量上调外,其它各基因表达水平无明显变化。暴露时间延长至 6 d 后,20 nm PVP-AgNPs的0.01 mg/L组线虫gab-1、ggr-1、dop-1和dop-2基因表达水平升高, 0.1 mg/L组线虫gab-1和dop-1基因表达量也升高,1 mg/L组线虫gab-1、dop-3、和dop-6基因表达量降低,10 mg/L组线虫线虫gab-1、ggr-1、ggr-3、dop-3、dop-4、dop-5和dop-6基因表达量均下调;20 nm AgNPs的0.01 mg/L组线虫dop-1和dop-2基因表达量升高,10 mg/L组ggr-2、ggr-3和dop-5基因表达量降低。上述研究表明纳米银暴露会对秀丽线虫神经元造成损伤,引起神经元发育异常,引起神经索断裂、神经元缺失,不同神经元间表现出敏感性差异,同时纳米银暴露影响线虫神经递质受体基因表达水平,两种纳米银中,20 nm PVP-AgNPs对递质受体基因的表达量的影响更明显。
综上所述,纳米银暴露对秀丽隐杆线虫具有明显的毒性作用,可导致线虫寿命缩短,身体发育异常,出现体长减小,体宽变大,同时,对秀丽线虫产生多方面神经毒性作用,使线虫出现运动障碍、摄食排便异常和学习记忆能力下降。两种纳米银均在1 mg/L及以上的暴露剂量下对线虫有明显神经毒性,0.1 mg/L及以下暴露剂量下纳米银对秀丽线虫并无明显神经毒性。相关神经元和受体基因检测结果显示,纳米银损伤了秀丽线虫多种神经元,对秀丽线虫神经递质受体也产生影响。本项研究为纳米银的慢性神经毒性研究提供了剂量参考,为深入探讨纳米银产生神经毒性的机制提供了线索。
本研究将两种具有不同表面性质的纳米银(20 nm PVP-AgNPs、20 nm AgNPs)分别暴露于模式生物秀丽隐杆线虫,研究低浓度(0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L)和较长期暴露(延长暴露48 h和慢性暴露6 d)条件下,两种纳米银对秀丽隐杆线虫的神经毒性作用,探讨纳米银引起的神经毒性与神经元和神经递质受体的关系以及不同包被对纳米银神经毒性的影响,进而初步探讨纳米银产生神经毒性的机制。
1、纳米银的表征和暴露后线虫体内银含量检测:表征结果显示,20 nm PVP-AgNPs、20 nm AgNPs两种纳米银的粒径分别为22.08 nm和20.14 nm;在超纯水中的水合粒径大小分别为52.29 nm和450.8 nm;Zeta电位分别为-16.78 mV和-1.89 mV。20 nm PVP-AgNPs团聚少、分散性好,20 nm AgNPs团聚多,分散性差,两种纳米银均呈球形颗粒。将野生型秀丽线虫(N2)分别暴露于0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L的20 nm PVP-AgNPs或20 nm AgNPs 48 h和6 d,用石墨炉原子吸收光谱法对线虫体内银含量进行检测,结果表明两种纳米银在相同暴露剂量下,暴露时间延长至6d后线虫体内银含量均明显高于暴露48 h,提示纳米银可在秀丽线虫体内蓄积。相同暴露条件下,20 nm PVP-AgNPs 各组线虫体内的银含量显著高于20 nm AgNPs组,表明PVP包被使纳米银分散性增强,更易进入线虫体内,产生蓄积。
2、纳米银对秀丽线虫的一般毒性效应研究:将 L1 期秀丽线虫分别暴露于两种纳米银后,对线虫的寿命、体长和体宽进行测量。暴露 48 h 后,20 nm PVP-AgNPs和20 nm AgNPs的1 mg/L、10 mg/L组线虫相对平均寿命分别降为对照组的87.52%、79.91%和94.18%、86.72%。暴露6 d后,20 nm PVP-AgNPs和20 nm AgNPs的0.1 mg/L、1 mg/L和10 mg/L组线虫相对平均寿命分别降为对照组的88.28 %、76.74%、70.65%和93.05%、81.63%、72.38%。两种纳米银暴露均会使秀丽线虫最长寿命和相对平均寿命减小,并且暴露时间越长,损伤作用越大。体长体宽测量结果表明,与对照组相比,暴露48 h后,20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组及20 nm AgNPs的10 mg/L组线虫体长减小、体宽增大;暴露6 d后,20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组线虫体长减小、体宽增大,0.1 mg/L组线虫体宽增大,20 nm AgNPs的10 mg/L组线虫体长减小,体宽增大,1 mg/L 组线虫体宽增大。以上结果显示纳米银暴露对线虫体长和体宽的影响趋势并不一致,随着暴露剂量的增加,两种纳米银均会使秀丽线虫体长减小,体宽增大。总体来说,两种纳米银对线虫寿命和生长发育的毒性损伤作用大小为:20 nm PVP-AgNPs>20 nm AgNPs。
3、纳米银对秀丽线虫神经毒性效应研究:对纳米银暴露后线虫的运动行为、摄食排便行为、学习记忆行为进行观察检测。与对照组相比,暴露48 h后,20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组及20 nm AgNPs的10 mg/L组线虫头部摆动频率降低、排便运动周期变长、线虫化学趋向性系数(CI)降低、IT曲线下降;两种纳米银的10 mg/L组线虫身体弯曲频率和咽泵运动频率均降低。暴露6 d后,与对照组相比,两种纳米银的1 mg/L和10 mg/L组线虫头部摆动频率、身体弯曲频率和咽泵运动频率均降低、排便运动周期变长、CI显著降低、IT曲线下降,此外,20 nm PVP-AgNPs的0.1 mg/L组线虫排便运动周期也开始变长。以上研究表明纳米银暴露对线虫产生神经毒性,影响线虫局部运动、摄食和排便以及学习记忆等多种神经活动,暴露时间越长,毒性作用越大。两种纳米银的神经毒性20 nm PVP-AgNPs>20 nm AgNPs。
4、纳米银对秀丽线虫神经元和神经递质受体的影响:将转基因线虫BZ555、EG1285、DA1240和LX929分别暴露于两种纳米银后对线虫体内的荧光强度进行检测。相对荧光强度统计分析结果显示:纳米银暴露48 h后,与对照组相比, BZ555 线虫两种纳米银的 10 mg/L 组相对荧光强度降低;EG1285 线虫 20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L组和10 mg/L组相对荧光强度均降低,20 nm AgNPs仅10 mg/L组相对荧光强度降低;LX929线虫20 nm PVP-AgNPs的10 mg/L组线虫相对荧光强度降低,其他剂量组和20 nm AgNPs各剂量组相对荧光强度均无明显变化;DA1240线虫各暴露组相对荧光强度均无明显变化。暴露6 d后,与对照组相比,BZ555线虫20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组和20 nm AgNPs的10 mg/L组相对荧光强度降低;EG1285线虫两种纳米银的1 mg/L和10 mg/L组相对荧光强度均降低;LX929线虫20 nm PVP-AgNPs的1 mg/L和10 mg/L组和20 nm AgNPs的10 mg/L组相对荧光强度降低;DA1240线虫各组相对荧光强度均无明显变化。进一步对纳米银暴露后线虫体内γ-氨基丁酸和多巴胺受体基因的表达量进行检查的,结果显示,线虫延长暴露于0.01 mg/L和0.1 mg/L的20 nm PVP-AgNPs后,与对照组相比,gab-1、ggr-1、dop-1基因表达量上调,1 mg/L组线虫ggr-2基因表达量下调,10 mg/L组线虫ggr-2、ggr-3和dop-3基因表达量下调;暴露于20 nm AgNPs后除0.01 mg/L和0.1 mg/L组线虫dop-1基因表达量上调外,其它各基因表达水平无明显变化。暴露时间延长至 6 d 后,20 nm PVP-AgNPs的0.01 mg/L组线虫gab-1、ggr-1、dop-1和dop-2基因表达水平升高, 0.1 mg/L组线虫gab-1和dop-1基因表达量也升高,1 mg/L组线虫gab-1、dop-3、和dop-6基因表达量降低,10 mg/L组线虫线虫gab-1、ggr-1、ggr-3、dop-3、dop-4、dop-5和dop-6基因表达量均下调;20 nm AgNPs的0.01 mg/L组线虫dop-1和dop-2基因表达量升高,10 mg/L组ggr-2、ggr-3和dop-5基因表达量降低。上述研究表明纳米银暴露会对秀丽线虫神经元造成损伤,引起神经元发育异常,引起神经索断裂、神经元缺失,不同神经元间表现出敏感性差异,同时纳米银暴露影响线虫神经递质受体基因表达水平,两种纳米银中,20 nm PVP-AgNPs对递质受体基因的表达量的影响更明显。
综上所述,纳米银暴露对秀丽隐杆线虫具有明显的毒性作用,可导致线虫寿命缩短,身体发育异常,出现体长减小,体宽变大,同时,对秀丽线虫产生多方面神经毒性作用,使线虫出现运动障碍、摄食排便异常和学习记忆能力下降。两种纳米银均在1 mg/L及以上的暴露剂量下对线虫有明显神经毒性,0.1 mg/L及以下暴露剂量下纳米银对秀丽线虫并无明显神经毒性。相关神经元和受体基因检测结果显示,纳米银损伤了秀丽线虫多种神经元,对秀丽线虫神经递质受体也产生影响。本项研究为纳米银的慢性神经毒性研究提供了剂量参考,为深入探讨纳米银产生神经毒性的机制提供了线索。