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结肠纤维化是溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）最常见的并发症之一,病因不明且难以治愈。目前,临床上治疗UC主要使用氨基水杨酸类、类固醇类和免疫抑制剂等药物,但这些药物的治疗目的是缓解UC症状,而不是彻底治愈UC,且易产生耐药性,副作用较大。因此阐明发病机理和开发新药是当前应对UC及其肠纤维化的研究重点。研究发现,藏药湿生扁蕾Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma中的酮类化合物具有抗UC肠纤维化的活性,因此该类化合物的深入开发和研究对防治UC肠纤维化具有重要意义。本文研究目的:分离纯化得到湿生扁蕾总酮（total xanthones from Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma,TXG）有效部位,研究其抗UC肠纤维化药理机制,探讨UC肠纤维化过程中结肠细胞自噬（autophagy）对上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的调控作用,并设计制备一种p H依赖型TXG结肠定位微丸,为进一步阐明UC肠纤维化发病机理和开发民族药来源的新药提供研究参考。方法:1.分离纯化TXG采用Zr OCl2比色法测定湿生扁蕾中总酮含量,并对该法进行方法学验证。通过静态吸附及解吸试验,优选出最佳树脂。以优选大孔吸附树脂为固定相,通过吸附动力学、热力学探讨吸附机理,并优化分离纯化工艺。2.药理机制研究将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、吡非尼酮（pirfenidone）阳性对照药组和TXG高、中、低剂量组(0.1386、0.0693、0.0347mg·g-1·d-1)。除正常对照组外,其余各组大鼠采用二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonic acid,DNBS）分2次间隔10 d诱导大鼠UC肠纤维化模型。于第1次造模次日起给药20 d,观察大鼠一般状态并对疾病活动指数（disease activity index,DAI）进行评分。末次给药后处死大鼠,取材后观察结肠黏膜大体形态改变,对结肠粘膜损伤指数（colonic mucosal damage index,CMDI）进行评分并计算结肠湿质量指数。苏木素-伊红（hematoxylin and eosin,HE）和Masson染色分别观察大鼠结肠组织病理学变化和纤维化程度。蛋白质印迹（Western blot,WB）检测结肠组织E-cadherin、α-SMA、N-cadherin、Col I、Col III、LC3-II/LC3-I、Beclin-1及p62蛋白的相对表达,实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR）检测TGF-β1、Smad2、Smad3及Snail 1 m RNA的相对表达。3.p H依赖型TXG结肠定位微丸的制备微丸处方筛选;采用挤出-滚圆法制备微丸载药丸芯,并以Box-Behnken响应面法优化挤出-滚圆工艺参数;流化床底喷法包衣;以TXG为指标,篮法测定p H依赖型TXG微丸的体外释放度;以体外释放度考察微丸丸芯包衣最佳增重百分比例;包衣微丸质量评价并用f2相似因子法评价批次间包衣微丸的体外释放过程相似性。结果:1.建立的TXG的含量测定方法精密度和准确度较好。优选大孔吸附树脂为DM130型树脂。吸附过程可以用准二级动力学、颗粒扩散动力学、Langmuir和Freundlich模型较好地解释,该过程为自发的、吸热的、熵增的吸附过程。分离纯化TXG的较优工艺为:上样液质量浓度1.5 mg·m L-1,洗脱剂为体积分数80%的乙醇,上样液p H为5,洗脱剂用量10倍柱体积（BV）,洗脱剂流速2 BV·h-1。按优化工艺分离纯化后,TXG含量由13.39%提高到51.26%（n=3）。2.（1）大鼠一般状态及DAI评分:与模型对照组比较,TXG各剂量组大鼠的一般状态均有不同程度的改善,DAI评分显著降低（P＜0.01）。（2）大鼠CMDI评分及结肠湿质量指数:与模型对照组比较,TXG各剂量组大鼠CMDI评分显著降低（P＜0.01）,结肠湿质量指数不同程度降低（P＜0.01）。（3）大鼠结肠组织病理学变化和纤维化程度:HE染色结果显示,与模型对照组比较,TXG各剂量组随药物剂量增加,结肠绒毛逐渐趋向变长,与基底膜连接更加紧密,绒毛排列趋向整齐,杯状细胞增多,整体组织内炎性浸润和出血都有明显减轻,TXG高、中结肠组织病理学评分显著降低（P＜0.01）;Masson染色结果显示,与模型对照组比较,TXG各剂量组大鼠结肠肌纤维排列不同程度趋向整齐,TXG高、中剂量组大鼠结肠组织胶原纤维面积比例显著减小（P＜0.01或P＜0.05）。（4）TXG对大鼠结肠组织EMT的影响:WB检测结果显示,与模型对照组比较,TXG各剂量组大鼠结肠正常上皮细胞标志物E-cadherin相对表达显著升高（P＜0.01）、间质细胞标志物α-SMA相对表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,TXG高、中剂量组大鼠结肠间质细胞标志物N-cadherin的相对表达显著降低（P＜0.01）,EMT过程不同程度减缓;与模型对照组比较,TXG各剂量组大鼠结肠组织中Col I和Col III的相对表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,大鼠UC肠纤维化EMT过程中Col I和Col III的积累减少。（5）TXG对大鼠结肠组织自噬水平的影响:WB检测结果显示,与模型对照组比较,TXG高、中剂量组大鼠结肠组织中LC3-II/LC3-I和Beclin-1蛋白的相对表达显著升高（P＜0.01或P＜0.05）,TXG高剂量组大鼠结肠组织p62蛋白的相对表达显著降低（P＜0.01）。LC3-II/LC3-I大小可表示自噬程度,Beclin 1是哺乳动物自噬效应蛋白,p62是自噬选择性底物、通过自噬降解,其表达水平反映自噬的强弱,故WB结果说明TXG可上调大鼠结肠细胞自噬水平。（6）TXG对大鼠结肠组织EMT信号通路的影响:与模型对照组比较,TXG各剂量组大鼠结肠组织中TGF-β1、Smad2、Smad3和Snail 1 m RNA的相对表达显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,说明TXG可抑制TGF-β/Smad信号通路和受其调控的EMT关键转录因子Snail 1 m RNA的相对表达。3.（1）微丸处方:药物成分（TXG）、MCC和微粉硅胶质量比5:3:2,以3%PVP的50%乙醇溶液作为润湿剂和粘合剂。包衣材料Eudragit?S100、增塑剂TEC和包衣抗黏剂滑石粉配制而成的80%乙醇溶液作为结肠定位包衣液。每100 m L包衣液中,含Eudragit?S1005 g、TEC 1 g、滑石粉2 g。（2）挤出-滚圆法制备微丸载药丸芯最佳工艺为:挤出速度40r.min-1、滚圆速度1100 r.min-1、滚圆时间3 min,在此条件下制得的微丸载药丸芯综合评分可达70.4。（3）选择包衣增重20%制得最终的包衣微丸。（4）质量评价和体外释放度评价结果显示,所得包衣微丸符合质量要求,微丸中的TXG在模拟胃液（p H 1.2的盐酸溶液）和模拟小肠液（p H 6.8的磷酸盐缓冲液）中释放得很少（模拟胃液和模拟小肠液中累积释放度＜5%）,在模拟结肠液（p H 7.8的磷酸盐缓冲液）中2 h后累积释放度可达90%以上。f2相似因子法评价结果显示,不同批次包衣微丸体外释放过程相似度好。结论:综上所述,本文通过大孔吸附树脂技术首次分离纯化得到TXG有效部位,并对其抗UC肠纤维化活性和药理机制进行了研究。结果表明,TXG有抗UC肠纤维化活性,其作用机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路和增强细胞自噬,从而抑制大鼠结肠组织EMT,最终有效抑制UC肠纤维化。病理研究再进一步,首次明确了在UC肠纤维化过程中,诱导结肠细胞自噬可以降低EMT的表达。为了克服TXG水溶性差、口服生物利用度低的缺点,本文又设计制备了一种p H依赖型TXG结肠定位微丸,所得微丸具有良好的体外结肠定位释放特征。以上研究成果可为进一步了解UC肠纤维化发病机制和从民族医药开发新的抗UC肠纤维化药物提供参考依据。