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研究目的: 器官移植技术的进步为脏器衰竭的患者带来了福音，免疫抑制剂的使用是移植后抗排异反应的有效手段。但这些药物往往价格很高，又会引起肝功能异常、高血压、糖尿病等不良反应。因此，中药大黄素(Emodin，Emo)成为科研人员研发诱导免疫耐受药物的新目标。 本科研组前期研究表明大黄素可以抑制树突状细胞（Dendritic cell，DC）的成熟和分化，并且能增加调节性T细胞的产生，可通过干扰肝移植后树突状细胞的成熟化从而诱导受体免疫耐受的发生，但详细机制还不清楚。本研究旨在前期研究的基础上，对大黄素和树突状细胞的体外相互作用机制进行进一步研究，继续深入探讨大黄素诱导免疫耐受的分子机制。 本研究以树突状细胞为研究对象，用共聚焦显微镜观察大黄素进入细胞的速度及在细胞内的分布情况。用液相色谱串联质谱测量细胞外的平均药物浓度，间接反映药物在细胞内定量分布;用流式细胞仪和酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)法检测大黄素对树突状细胞表型、细胞凋亡、细胞因子表达的影响，反映大黄素对树突状细胞的成熟干预。 研究方法: 第一部分 1.收集并培养树突状细胞; 2.倒置相差显微镜下观察不同时间点树突状细胞的形态变化; 3.荧光显微镜下观察不同时间点、不同浓度大黄素在树突状细胞内的分布。 第二部分 待细胞贴壁后，每孔均加入浓度为10μg/ml的大黄素进行处理，分别在加药后的第5min，15 min，30 min，60 min，90 min，120 min，180 min，240 min，300min取其上清液用高效液相色谱串联质谱检测细胞外液大黄素浓度 第三部分 1.树突状细胞培养后，分别加入不同浓度的大黄素25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml进行处理。用ELISA法检测树突状细胞培养液上清液细胞因子的表达情况。 2.在培养好的树突状细胞中加入不同浓度的大黄素25μg/ml、50μg/ml、100ug/ml、150μg/ml处理90min后，分别加入FITC标记的MHC-Ⅱ抗体和PE标记的CD80抗体，用流式细胞仪测细胞表面标记物。 研究结果: 第一部分 1.树突状细胞培养24h后开始有贴壁生长，第7天起有集落形成。 2.大黄素浓度在10ug/ml时，荧光显微镜下观察大黄素在树突状细胞的细胞核周围选择性分布，颗粒分布均匀，形态清晰。在大黄素浓度＜50μg/ml时，随着大黄素浓度的增加，荧光强度有所增强。随着大黄素浓度的进一步增加，荧光显微镜下观察荧光改变不明显。 3.大黄素在树突状细胞内分布迅速，随着时间的延长，荧光强度有所增加，在2h左右比较稳定。随着时间的进一步延长，荧光强度无明显改变。 第二部分 大黄素在细胞培养液中的浓度迅速下降，90min左右浓度最低，后随着时间的延长，细胞培养液中的浓度又复上升，但均低于初始浓度。 第三部分 1.ELISA法测定结果:大黄素浓度在0-25μg/ml的范围内，IL-10表达基本呈下降趋势，随着浓度的进一步升高，IL-10表达与浓度关系不存在负相关。大黄素浓度在在0-25μg/ml时TGF-β的表达逐渐下降，在大黄素浓度为50μg/ml时表达值反而上升，达到最大值，后又逐渐下降。在大黄素浓度为20-400μg/ml时，IL-12的分泌呈逐渐下降的趋势。但大黄素组与空白组比较均无统计学意义。 2.流式细胞仪检测结果:随着大黄素浓度的增加，MHC-Ⅱ、CD80的表达均减少，但相对于MHC-Ⅱ，CD80的减少不是很明显。 结论: 大黄素在树突状细胞内迅速稳定，并在细胞内选择性分布，绝大多数以颗粒形态分布于细胞核周围的胞浆内。给药90min左右，大黄素在细胞内的浓度最高，后逐渐下降，表明树突状细胞可能存在主动外排机制。 大黄素可以抑制树突状细胞向成熟方向发展，有一定的免疫抑制作用。大黄素浓度在0-25ug/ml时，对MHC-Ⅱ、CD80、IL-10、IL-12、TGF-β的表达均呈现浓度依赖性的减少;在25-50ug/ml时对TGF-β有较好的抑制作用。部分细胞因子如MHC-Ⅱ、CD80的分泌与大黄素浓度负相关。 在现有的检测条件和检测方法下，虽然表达曲线有改变，但对细胞因子的表达无统计学意义(P＞0.05)，仍有待进一步的深入研究和探讨。