第一部分　　 活动依赖刺激上调SHSY5Y细胞整体SUMO化修饰及其机制的研究　　 研究背景:　　 SUMO化修饰是近年来发现的一种蛋白质翻译后修饰。已有越来越多的证据表明,SUMO化修饰在神经系统中发挥着重要的作用,但有关其在麻醉相关领域中的作用研究,目前还是一片空白。麻醉及其相关领域研究的关键作用靶点是神经元。而活动依赖刺激(Activity-Dependentstimuli)在调节神经元数目和功能中发挥重要作用,参与了麻醉相关的各个领域,如全麻药物的作用机理,疼痛的发生机制等。因此,探讨整体SUMO化修饰在活动依赖刺激中的作用机制,将有可能为今后进一步研究SUMO化修饰这一蛋白质翻译后修饰在麻醉相关领域中的作用奠定基础。有鉴于此,本研究拟以逆转录病毒系统构建分别表达Flag-SUMO1、Flag-SUMO2、Flag-SUMO3的SHSY5Y稳转细胞系,通过氯化钾引起的去极化刺激作为活动依赖刺激,观察上述三株细胞受刺激后Flag-SUMO1、Flag-SUMO2、Flag-SUMO3的细胞内定位和表达的变化,以及使用钙螯合剂和氯化钾后的变化,来探讨SUMO化修饰在活动依赖刺激中的作用机制。本研究设计基于以下几点重要的研究发现:1、SUMO化修饰参与神经系统的一些重要过程,如神经发育和突触递质的释放。2、氯化钾引起的细胞膜去极化刺激作为活动依赖刺激能够引起神经元钙内流增加。3、钙内流的增加能够引起细胞内信号转导通路的激活,其中钙离子和受Ca2+/钙调素调节的钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN),均是介导钙内流效应的关键调节因子,且在以往的文献中均被认为参与了神经系统的活动依赖过程。　　 方法：　　 运用逆转录病毒系统构建三株分别表达Flag-SUMO1,Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的SHSY5Y稳转细胞系；以氯化钾引起的细胞膜去极化刺激做为活动依赖刺激处理上述三株细胞不同的时间后,运用免疫印迹实验和免疫荧光实验分别检测Flag-SUMO1、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的表达和细胞内定位变化；再以钙离子螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)和 CaN特异性抑制剂环孢霉素(cyclosporin A,CsA)与氯化钾同时处理上述三株细胞,免疫印迹实验分别检测Flag-SUMO1、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的表达。　　 结果：　　 1)成功构建了三株分别表达Flag-SUMO1、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的SHSY5Y稳转细胞系。　　 2)活动依赖刺激上调SHSY5Y稳转细胞系中SUMO化修饰:其中SUMO1和SUMO3的变化呈时间依赖性,而SUMO2呈双相变化。　　 3)活动依赖刺激处理三株SHSY5Y稳转细胞系60min后,SUMO1和SUMO3的定位发生改变,而SUMO2的定位没有明显变化。　　 4)钙内流介导了活动依赖调节的SUMO化修饰。　　 结论：　　 活动依赖刺激上调SHSY5Y细胞整体SUMO化修饰,这一过程呈时间依赖关系,并被钙内流所介导。　　 第二部分　　 异丙酚上调整体SUMO化修饰对过氧化氢引起的SHSY5Y细胞死亡的保护作用　　 研究背景:　　 SUMO化修饰是近年来发现的一种蛋白质翻译后修饰。根据相关文献报道,SUMO化修饰在过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激下能够激活,但是其在该过程中的作用并不明确。基于此,我们首先研究在H2O2引起的细胞凋亡过程中SUMO化修饰发挥的作用。其次,根据临床常用静脉麻醉药物异丙酚的化学结构与内源性抗氧化剂α-生育酚(维生素E)十分相似,因此也具有抗氧化作用的特点,我们探讨了SUMO化修饰是否参与了异丙酚在H2O2处理过程中的抗氧化作用。也即本部分研究的主要目的是探讨SUMO化修饰在异丙酚抗氧化效应中的作用机制。　　 方法：　　 分别表达Flag-SUMO1、Flag-SUMO2和Flag-SUMO3的SHSY5Y稳转细胞系,以H2O2(200 mM)处理6个小时后,用Annexin-Ⅴ方法检测不同细胞的死亡率和生存率,从而探讨不同的SUMO化修饰在H2O2处理引起细胞死亡过程中的作用。随后,将SHSY5Y细胞在不同浓度异丙酚(50μM、100μM、200μM和500μM)预处理后,再给予H2O2(200mM)处理6个小时,以细胞增殖和毒性实验(CCK-8)来检测异丙酚的保护作用。同时用免疫印迹实验分别检测该过程中细胞内源性SUMO1、SUMO2/3的变化。　　 结果：　　 1)过表达Flag-SUMO1、Flag-SUMO2的SHSY5Y细胞系在H2O2处理后与正常细胞相比死亡率明显降低。而过表达Flag-SUMO3的SHSY5Y细胞在H2O2处理后与正常细胞相比,细胞死亡率没有明显变化。　　 2)异丙酚预处理后,对H2O2处理引起的SHSY5Y细胞凋亡有保护作用,在此过程中,SUMO1,SUMO2/3的表达发生了改变。　　 结论：　　 SUMO1、SUMO2能够保护H2O2处理引起的细胞死亡。SUMO化修饰参与了异丙酚抗氧化作用。