心肾综合征(cardiorenal syndrome, CRS)是指患者同时存在心功能不全和肾损害,且两者之间存在复杂相互作用的临床综合征。心脏疾病对肾功能有多方面的损害,肾功能不全也会显著损害心功能,最终导致心肾衰竭。CRS包括不同的心脏和肾脏的病理生理障碍,任一器官的急慢性功能障碍均可导致另一器官的急慢性功能障碍3。CRS的原发性受损器官可以是心脏也可以是肾脏。导致心肾同时出现损伤和/或功能障碍的全身状态也是CRS的亚型之一3。随着心、肾功能疾病发生率的与日俱增,CRS的发生呈逐年增加趋势,是临床亟待解决的重要课题。目前对CRS的认识和防治尚未取得显著进展,给CRS的防治带来了极大的障碍。深入探讨CRS病理生理机制对防治CRS具有重要的基础理论和临床指导价值。心肾相互作用是CRS发生的关键,其病理生理机制尚未阐明。CRS各分型之间在病理机制上存在一些共同特征：原发衰竭器官导致一系列反应机制如神经内分泌系统包括交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统等、氧化应激、炎症反应、血流动力学紊乱、高血压等通过介导心肌细胞纤维化、心肌肥大、肾间质细胞纤维化、肾小球硬化等病理生理机制的激活。这些机制可能在早期阶段发挥一定的代偿作用,但从长远来看最终将导致心肾功能衰退,或者在最初就引发另一器官的继发性功能失调。近年来,针对以上病理生理机制,采用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors, ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor antagonism, ARB)、醛固酮受体拮抗剂(aldosterone receptor antagonist, MR)、β-’肾上腺素受体阻滞剂以及血液透析等措施防治心、肾功能衰竭的疗效已被临床和基础研究证实,但仍未能阻止CRS的发生发展,提示可能存在其它机制导致心肾交互损害,促进CRS的发生发展。尿毒症毒素在CRS中的作用日益受到重视,尤以硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)的作用最为突出。已有研究认为IS(1)主要由肾脏清除,难以通过透方式析清除；(2)剂量依赖性促大鼠心肌纤维母细胞纤维化和心肌细胞肥大作用；(3)促进远端肾小管损伤、肾间质纤维化、肾小球硬化、以及肾组织超氧化物清除能力降低,加剧肾功能损伤等作用。因此,目前认为IS具有导致心肾交互损害的基本特征。然而,已有研究存在的问题是：IS与CRS患者心功能衰竭的具体关系尚未明确,IS促进心肌肥大、心肌成纤维细胞纤维化等作用机制尚未阐明。对上述问题的阐明将有助于明确IS在CRS中的作用,并未进一步筛选治疗靶点提供依据。为解决上述问题,本研究将以下几个方面展开：第一章外周血硫酸吲哚酚与心肾综合征患者心功能的关系研究研究目的：临床试验入手探讨IS与CRS心功能损伤的关系。研究方法：选择20011年11月至2012年12月在我院检查及治疗的年龄在(30-70)岁的CRF患者共90例,其中男性53例,女性37例。入选对象需满足以下条件：(1)签署知情同意书；(2)肾小球滤过率(Glomerular Filtration Rate, GFR)<15ml/min·1.73m2≥3个月,有或无肾脏损伤的证据；(3)药物、血液透析获采取任何治疗方式；(4)符合Ronco3等总结的CRS诊断标准；(5)排除：心脏瓣膜病、风湿性疾病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、限制型心肌病、感染性心内膜炎、缩窄性心包炎、先天性心脏病、肿瘤、甲状腺功能亢进。抽取患者空腹静脉血10ml,其中7ml静脉血送珠江医院检验科行血常规、生化等指标检测,剩余3ml静脉血标本,用于高效液相色谱-荧光检测法对硫酸吲哚酚含量进行测定分析。利用MDRD公式计算GFR对肾功能进行评价。心脏超声对患者心脏结构和功能等相关指标进行检测。依据IS水平将所有研究对象分为高IS组和低IS组。结果：通过对CRF患者外周血IS浓度、临床基本资料、心脏超声等指标进行检测分析,发现：高IS组(IS>35ng/dL)在冠心病占人群比例、肌酐、GFR、BNP、LVPW、E/e’等较低IS组升高有显著性意义。进一步利用简单线性回归分析显示IS浓度水平可能与性别、NYHA分级、高脂血症、冠心病、脑梗死、糖尿病、服用抗血小板药物、利尿剂、他汀类药物、GFR、BNP、LVDd、IVST、 LVEF、LVMI、DCT、E/e’等因素相关。为进一步明确IS的影响,我们还利用多元线性回归逐步分析,结果显示利尿剂、GFR, BNP、LVEF、LVMI以及E/e’可明显影响IS浓度变化；其中利尿剂、BNP、LVMI以及E/e’可能是IS的正相关影响因素,GFR, LVEF可能是IS的负相关影响因素。结论：CRF患者体内IS蓄积与心肾功能相关。为明确IS是否发挥CRS导致心功能损伤的桥梁作用,我们将利用动物模型进行进一步研究。第二章硫酸吲哚酚与CRS大鼠模型心功能的关系研究研究目的：通过动物实验进一步证实IS与CRS心功能损伤的关系。研究方法：选用雄性SD大鼠分为假手术组(Sham+Sham)、心肌梗死组(MI+Sham)、STNx组(Sham+STNx)以及心肌梗死+STNx组(MI+STNx)。采用无创血压监测系统对大鼠血压进行监测,超声心动图对大鼠心脏结构和功能进行检测,计算大鼠GFR,以HPLC-FLU法对大鼠血清IS含量,对大鼠梗死面积,非梗死区域间质纤维化,心肌细胞肥大等相关指标进行检测,采用定量PCR法对大鼠非梗死组织miR-34a表达进行检查。结果：1建模后大鼠生存率和梗死面积比较假手术组(Sham+Sham)、心肌梗死组(MI+Sham)、STNx组(Sham+STNx)以及心肌梗死+STNx组(MI+STNx)大鼠生存率分别为100%、59.7%、91.7%和44.1%。心肌梗死组和心肌梗死+STNx组的大鼠心肌梗死面积比较,差异无显著性意义。2各组大鼠血压比较14周后STNx组、MI+STNx组较其它两组大鼠血压升高有显著性意义；其中MI+STNx组大鼠收缩压较STNx组降低有显著性意义(P<0.05)。3心脏组织重量MI+STNx组大鼠的心脏体重比和左室体重比高于MI+Sham组大鼠有显著性意义；Sham+STNx组大鼠心脏体重比和左室体重比较MI+Sham组增加有显著性意义(P<0.01)。4心脏超声检查结果MI+Sham组和MI+STNx组大鼠心脏LVEF较其它两组降低有显著性意义,其中MI+STNx组较MI+Sham组的大鼠心脏LVEF降低有显著性意义(P<0.001)。Sham+STNx组LVMI和E/e’较其它三组升高有显著性意义(P<0.001)。5血流动力学变化与MI+Sham组相比,MI+STNx组大鼠收缩压、舒张压以及LVEDP升高(P<0.05),CO降低(P<0.05)。与Sham+Sham组相比,MI+Sham组和MI+STNx组的dP/dt max和dP/dt min减少有显著性意义(P<0.05)；但MI+Sham组和MI+STNx组两组在dP/dt max和dP/dt min指标上相比,差异无显著性意义(P>0.05)。与Sham+Sham组相比,收缩功能相关指标如PRSW和ESPVR在MI+Sham组和MI+STNx组减少有显著性意义(P<0.05)。6心肌间质纤维化天狼猩红染色结果显示：与Sham+Sham组相比,其余3组左室非梗死区心肌间质纤维化增加有显著性意义(P<0.01)；与MI+Sham组相比,MI+STNx组左室非梗死区心肌间质纤维化增加有显著性意义(P<0.01)。7心肌细胞横截面积根据HE染色结果,与MI+Sham组相比,在MI+STNx组的左室非梗死区域心肌细胞横截面积升高有显著性意义(P<0.05)；与Sham+Sham组相比,心肌细胞横截面积在MI+Sham组和Sham+STNx组升高有显著性意义(P<0.05)。8肾功能和血浆IS水平与Sham+Sham组和MI+Sham组相比,Sham+STNx组和MI+STNx组大鼠GFR降低,CrCl、血肌酐水平、IS含量升高等有显著性意义(P<0.01)。9Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白以及miR-34a的表达免疫组织化学染色分析显示大鼠心肌非梗死区域Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的表达在STNx+MI组和Sham+STNx组较Sham+Sham组和Sham+MI组增强有显著性意义(P<0.05)；定量PCR检测结果显示大鼠心肌非梗死区域miR-34a的表达在STNx+MI组和Sham+STNx组较Sham+Sham组和Sham+MI组增强有显著性意义(P<0.05)；Ⅲ型胶原蛋白的表达和miR-34a在STNx+MI组较Sham+STNx组升高有显著性意义(P<0.05)。10miR-34a与IS、心肌肥大和心肌纤维化的相关性分析相关性分析结果显示非梗死区域miR-34a表达与大鼠外周血肌酐(r=0.881,P<0.001)、LVEDP(r=0.746, P<0.001)、心肌间质纤维化面积(r=0.897,P<0.001)、心肌细胞横截面积(r=0.834,P<0.001)、胶原蛋白Ⅰ(r=0.927,P<0.001)、胶原蛋白Ⅲ(r=0.911,P<0.001)、外周血IS含量(r=0.903,P<0.001)正相关,与-dP/dtmin (r=-0.417, P=0.018)、PRSW (r=-0.658, P<0.001)、GFR (r=-0.938,P<0.001)、肌酐清除率(r=-0.944,P<0.001)负相关；提示miR-34a可能参与了IS介导CRS心功能衰竭的病变进程。结论：本章研究利用大鼠心肌梗死+STNx建立CRS模型证实IS与心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞纤维化、以及心肾功能损伤密切相关。该模型初步证实MI+STNx可以使大鼠心肾功能恶化、心肌重塑加剧。miR-34a可能参与了IS介导CRS心功能衰竭的病变进程。第三章miR-34a在硫酸吲哚酚促心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞纤维化中的作用研究目的：明确miR-34a与IS促心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞纤维化作用之间的关系。研究方法：首先分离培养乳鼠心肌细胞(newborn mice cardio-myocytes,NCMS)和乳鼠成纤维细胞(newborn mice cardio-fibroblasts, NCFs)。分别构建miR-34a过表达载体和抑制表达载体,转染根据实验设计分为以下几组,即对照组、IS组、anti-miR-34a+IS组、miR-34a组以及miR-34a+IS组。其中对照组不给予任何干预措施,IS组给予IS刺激,anti-miR-34a+IS组在anti-miR-34a转染NCMs、NCFs基础上予以IS刺激,miR-34a组仅给予以miR-34a转染NCMs、 NCFs,miR-34a+IS组则在miR-34a组基础上予以IS刺激。IS刺激终浓度为20μM。48小时候后收集NCMs、NCFs,抽提RNA用于Real time PCR检测以及提取蛋白用于western blotting检测蛋白表达水平,以及3H标记亮氨酸法检测NCMs巴大和NCFs纤维化。结果：1各组细胞miR-34a的表达在NCMs各组细胞中miR-34a的表达有显著性意义(F=199.976,P<0.001),在NCFs各组细胞中miR-34a的表达有显著性意义(F=482.752,P<0.001)。相对于对照组,NCMs和NCFs的IS组中miR-34a的表达倍数约分别升高2.15倍和1.91倍(P<0.001)；NCMs和NCFs的miR-34a组中miR-34a的表达倍数约分别升高2.63倍和2.44倍(P<0.001),NCMs和NCFs的anti-miR-34a组中miR-34a的表达倍数约分别为对照组的0.61倍和0.73倍(P<0.001), NCMs和NCFs的IS+anti-miR-34a组中miR-34a的表达倍数约分别为对照组的0.78倍和0.74倍(P<0.001)。2IS及miR-34a对NCMs、NCFs3H标记亮氨酸摄取率的影响NCMs、NCFs3H标记亮氨酸摄取率在5组间相比,差异有显著性意义(P<0.001)；与其它三组相比,miR-34a组最多(P<0.001)；Anti-miR-34a组最少(P<0.05)；以上结果提示miR-34a可促进NCMs、NCFs3H标记亮氨酸摄取率。见表3-2。3IS及miR-34a对NCMs、NCFs各组Notch-1蛋白表达的影响Western blotting检测显示与对照组相比,IS组和miR-34a组Notch-1蛋白表达下调,anti-miR-34a组和IS+miR-34a组Notch-1表达上调,提示miR-34a可能通过上调miR-34a表达进而抑制Notch-1的表达。结论：IS可能通过miR-34a促进心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞纤维化；这种作用可能部分通过作用于Notch-1实现的。通过上述各部分实验,我们能够得出以下结论：(1)CRF患者体内IS蓄积与心肾功能明显相关。(2)本章研究利用大鼠心肌梗死+STNx建立CRS模型证实IS与心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞纤维化、以及心肾功能损伤密切相关。miR-34a可能参与了IS介导CRS心功能衰竭的病变进程。(3)IS可能通过miR-34a促进心肌细胞肥大和心肌成纤维细胞纤维化；这种作用可能部分通过作用于Notch-1实现的。