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目的:脑出血(intracerebralhemorrhage,ICH)后继发损伤是一个复杂的病理生理过程,至今未阐明,近几年来研究表明基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)是导致ICH后继发损伤重要因素,能促进炎症反应发生,加重脑水肿,使神经功能缺失加重。本实验通过观察大鼠ICH后基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase,MMP-9)蛋白动态表达及其与血肿周围脑组织含水量的关系,和观察七叶皂苷钠对MMP-2、MMP-9表达的影响,探讨MMP-2、MMP-9在ICH的损伤机制,进一步了解ICH后继发损伤的病理生理过程,为治疗ICH提供理论依据。
方法:将雌雄各半Wistar大鼠250只随机分为4组:正常对照组、假手术组、ICH组和七叶皂苷钠治疗组。每组均观察手术后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15d八个时间点各观察指标的改变,每个时间点10只大鼠。治疗组模型:按照50mg/kg.d七叶皂苷钠在各时间点向大鼠ICH腹腔注射。ICH组模型:采用立体定向仪把自体血注入大鼠右侧尾状核制作大鼠ICH动物模型。假手术组模型:手术操作程序与ICH组相同,但尾状核不注入自体血,针留置约10分钟。正常对照组模型:大鼠不进行手术。在术后2h进行模型成功评价,分别于术后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15d进行神经功能障碍评分。在术后各相应时间点取5只大鼠灌注固定后取材作脑片,进行免疫组织化学染色和HE染色,观察MMP-2、MMP-9蛋白动态表达。根据显色的强弱,将免疫组织化学的结果分为4级:(一)为阴性,(+)为弱阳性,(++)为中等阳性,(+++)为强阳性。取连续组织切片在同一强度及放大倍数观察,采用阳性细胞计数法。每只大鼠每个指标选一张脑切片,在400倍光镜下随机选测血肿周围的4个互不重叠的视野,每个时点共计20个视野,计数每个视野的该指标阳性细胞数,取均数为各时点该指标阳性细胞数。另取5只大鼠在术后各相应时间点断头取脑组织,用干湿重法测定血肿周边脑组织含水量。
结果:在实验过程中36只大鼠死亡,ICH组和治疗组有15只大鼠手术后模型评价为0级,手术成功率84.75%。ICH组在6h~120h的神经功能评分与正常对照组、假手术组、治疗组比较,神经功能评分下降,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。在ICH组,24h~48h神经功能评分显著降低,在48h神经功能评分与24h相比,差异无显著性(P=0.51),与其它各时点相比,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);ICH组在6h~72h脑组织含水量与正常对照组、假手术组、治疗组比较,血肿周围脑组织含水量升高,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000);在ICH组,24h~48h血肿周围脑组织含水量达高峰,在48h血肿周围脑组织含水量与24h相比,差异无显著性(P=0.16),与其它各时点相比,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);ICH组各时间点MMP-2蛋白表达与正常对照组、假手术组、治疗组比较,MMP-2蛋白表达升高,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000);在ICH组,MMP-2蛋白表达在6h达到高峰,与其它各时间点相比较,差异具有显著性(P=0.000;P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);ICH组各时间点MMP-9蛋白表达与正常对照组、假手术组、治疗组比较,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000);在ICH组,MMP-9蛋白表达在24h~48h达高峰,在24hMMP-9蛋白表达与48h相比,差异无显著性(P=0.119),与其它各时间点比较,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000,P=0.000);在假手术组,MMP-2蛋白表达与血肿周围脑组织含水量无相关性(r=0.135,P=0.751),MMP-9蛋白表达与血肿周围脑组织含水量无相关性(r=-0.433,P=0.284),MMP-2蛋白表达与MMP-9蛋白表达无相关性(r=-0.505,P=0.202)。在ICH组,MMP-2蛋白表达与血肿周围脑组织含水量无相关性(r=-0.009,P=0.983),MMP-9蛋白表达与血肿周围脑组织含水量有相关性(r=0.949,P=0.000),MMP-2蛋白表达与MMP-9蛋白表达无相关性(r=0.038,P=0.928)。在治疗组,MMP-2蛋白表达与血肿周围脑组织含水量无相关性(r=-0.434,P=0.284),MMP-9蛋白表达与血肿周围脑组织含水量有相关性(r=0.907,P=0.002),MMP-2蛋白表达与MMP-9蛋白表达无相关性(r=-0.076,P=0.858)。HE染色:正常对照组、假手术组大鼠脑组织结构完整,各层细胞排列整齐,无肿胀。ICH组大鼠脑组织在注血后6h可见血肿周围散在中性粒细胞等炎细胞浸润;24h可见神经细胞数目减少,排列紊乱,神经细胞、胶质细胞轻度肿胀,大量中性粒细胞浸润;48h血肿周围细胞肿胀明显,神经细胞变性、坏死,出现大量泡沫细胞,组织疏松明显,表现重度水肿;120h软化区组织疏松减轻,小胶质细胞增生,可见少许新生毛细血管。七叶皂苷钠治疗后与上述病理改变有不同程度的改善。
结论:自体血制作大鼠ICH动物模型,制作方法简单,易于操作,与人脑出血病理生理变化基本一致,可作广泛使用ICH动物模型。ICH后大鼠脑组织内MMP-2、MMP-9的蛋白表达增加及脑组织含水量增多,说明MMP-2、MMP-9参与了BBB的损伤,加重脑水肿。MMP-2的蛋白表达在6h达高峰,以后逐渐下降,说明MMP-2主要在早期参与BBB的损害,促进脑水肿的形成;MMP-9蛋白表达开始在6h上升,24h~48h达高峰,以后逐渐下降,说明MMP-9主要在中、晚期参与BBB的损害,加重脑水肿;七叶皂苷钠能降低MMP-2、MMP-9蛋白表达和脑组织含水量,显著减轻大鼠神经功能缺失,说明七叶皂苷钠对ICH具有保护作用。本实验证实MMP-2、MMP-9是ICH后继发损伤重要因素,七叶皂苷钠能抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达,为临床治疗ICH提供实验依据。