本研究以不同品种马为研究对象,利用 PCR 技术,首次成功地克隆了 6 个品种马的生长激素基因 1923bp 的片段(GenBank 登录号:AY837571),包括全部外显子和内含子。测序后,对其序列结构、核苷酸组成及所编码的氨基酸进行了初步研究,并利用 DNAMAN、DNAStar、Mega2.1、PAUP4.0 等生物学软件,构建了马 GH 基因进化树,同时对各品种马 GH 基因序列进行了 PCR-SSCP 和 PCR-RFLP 分析。研究结果表明: 1、马 GH 基因含有 5 个外显子和 4 个内含子,5 个外显子大小分别为:10 bp、161 bp、117 bp、162 bp 和 201 bp;4 个内含子大小分别为 253 bp、213 bp、199 bp 和 272 bp。外显子数目、大小、位置与哺乳类其他物种相比,表现出高度保守性。 2、马 GH 基因序列核苷酸组成富含 GC(60%以上),且外显子 GC 含量(61%)明显高于 5’端和 3’端的非编码区。编码氨基酸的密码子不同位点 GC 含量也有显著差异,表现为第一、第三位碱基富含 GC,且第一位碱基的 GC 含量接近于全序列,第三位碱基 GC 含量远高于其它位点,达 84.1%,第二位碱基富含 AT。密码子碱基组成的差异因物种不同而异,具有种属特异性。 3、马 GH 基因外显子在编码氨基酸时,对同义密码子的使用表现有强烈的偏好性。不同物种对同义密码子使用的偏倚程度与偏好类型各不相同,也具有种属特异性。 4、马 GH 基因所编码的蛋白质中,20 种氨基酸的含量差异很大。亮氨酸(L)含量最高,达 14.28%;色氨酸(W)最低,为 0.93%。极性氨基酸酸含量(54.99%)高于非极性氨基酸(45.01%)。此外,半胱氨酸(C)的含量与其他哺乳类完全一样,均为 5 个,而且半胱氨酸的位置在不同物种中高度保守,说明半胱氨酸对维持 GH 的空间结构起到极其关键的作用。 5、马 GH 氨基酸位点的进化演变表明,马各品种间氨基酸差异数很少,仅有 0～5个氨基酸不同,说明相互间的进化距离很小。马与人及其它动物相比较,进化距离由近至远依次为猪、狗、牛、羊和人。 6、采用不同方法构建的马 GH 基因进化树表明,马 GH 基因不同区段进化速率不同,外显子区域进化速率最慢;内含子序列中碱基变异频繁,进化较快。进化树分枝显示,乌珠穆沁马、三河马、锡尼河马三个品种与其它品种间已形成明显的进化分歧。 7、PCR-SSCP 分析结果表明,在所检测的 5’端侧翼区、第一内含子、第二外显子和第五外显子四个位点中,仅第五外显子检测到多态,该多态位点由 A 和 B 两种等位基因控制。GH 基因第 1719bp 处一个 T→C 的突变和 1743 处 G→A 的突变,导致等位基因 B 变为等位基因 A。除纯血马外,A 基因在各品种中均为优势等位基因,B 基因为纯血马的优势基因。在此多态位点,乌珠穆沁马、乌审马和巴尔虎马处于 Hardy-Weinberg 平衡状态,纯血马、三河马和锡尼河马则未达到 Hardy-Weinberg 平衡状态。 8、对马 GH 基因全序列进行 PCR-RFLP 分析,采用四种限制性内切酶 BstⅪ、HindⅢ、SmaⅠ和 StuⅠ进行酶切,仅后两种酶检测到多态。SmaⅠ位点出现 A、B 两种等位基因,在 GH 基因序列的 1256bp 处发生 T→C 的转换,导致产生 1 个 SmaⅠ的酶切位点 CCC↓GGG,从而使基因型 AA 变为基因型 BB。在该位点乌审马 B 基因频率最高,为 0.667,纯血马 A 等位基因频率最高,达 0.643。乌审马、乌珠穆沁马和巴尔虎马处于 Hardy-Weinberg 平衡状态,锡尼河马、三河马和纯血马处于非平衡状态。 StuⅠ位点存在 C 和 D 两种等位基因,在 GH 序列的 1353bp 处发生了 C→T的变化,导致产生一个 StuⅠ的酶切位点 AGG↓CCT,使基因型 CC 变为基因型DD;C 基因为锡尼河马的优势等位基因,基因频率达 0.63,D 基因是纯血马的优势等位基因,基因频率为 0.74。该位点上,只有乌审马处于 Hardy-Weinberg平衡状态,其余品种均未达到 Hardy-Weinberg 平衡。 9、本研究首次对几个品种马 GH 基因序列、分子进化及其多态性进行了初步研究,研究结果对今后合理利用、开发和保护我国马种的遗传资源具有一定的指导意义。