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铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD,CSD)是植物中主要的活性氧清除剂,CSD的激活主要有CCS依赖途径和非CCS依赖途径。为研究CCS与CSD1在低温胁迫下的关联性,利用双基因植物二元表达载体,构建了过量表达CSD1(细胞质CSD)和CCS的pBD-EuCSD1+CCS以及过量表达CSD1同时CCS沉默的pBD-EuCSD1+antiCCS双基因植物二元表达载体。本文通过优化巨尾桉转化再生体系再生出转pBD-EuCSD1+CCS和pBDEuCSD1+antiCCS巨尾桉,筛选出转基因阳性巨尾桉;比较转基因阳性巨尾桉的抗寒性,筛选得到抗寒性强的转基因巨尾桉;对其进行生理生化研究,探究CCS与巨尾桉抗寒性的关系。结果如下:优化了巨尾桉转化再生体系:采用巨尾桉的茎为再生材料;芽分化培养基为:1/2 MS+0.1 g肌醇+30 g蔗糖+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/LNAA;芽生长培养基为:1/2 MS+0.1 g肌醇+30 g蔗糖+0.3 mg/L 6-BA+0.15 mg/L IBA。通过检测筛选,得到了16株转pBD-EuCSD1+CCS阳性巨尾桉,10株转pBDEuCSD1+antiCCS阳性巨尾桉。进行-15℃冷冻处理后,发现CCS过表达的巨尾桉抗冻性更强。CCS过表达的有9株可以耐受6 h冻害胁迫无萎蔫现象,正常培养后没有冻伤表型;CCS表达量降低的仅有F-10的抗冻能力较强;野生对照及转基因阴性对照巨尾桉均完全死亡。4℃低温胁迫检测SOD酶活,发现EuCSD1+CCS巨尾桉的SOD酶活性大部分高于EuCSD1+antiCCS巨尾桉。CCS过表达巨尾桉中SOD酶活性受胁迫后整体比CK高,CCS表达量降低的转基因巨尾桉中SOD酶活性进行低温胁迫前高于CK,受胁迫后低于CK。QPCR分析转基因植株的EuCSD1、EuCCS和EuGR在低温胁迫下的表达,发现转入了EuCSD1+CCS巨尾桉中CSD1和CCS的含量远高于EuCSD1+antiCCS巨尾桉。CCS过表达巨尾桉中CCS的变化趋势与CSD1的变化趋势一致呈先增高后降低;CCS低表达巨尾桉中CCS的表达量无明显变化,表达量较低。可见,响应低温胁时,CCS是激活CSD1的主要途径,提高了巨尾桉的抗寒性。GR与CSD1和CCS的变化趋势无明显相关性,但推测GR会参与巨尾桉抗冻胁迫反应。比较转EuCSD1+CCS与EuCSD1+antiCCS巨尾桉木质素含量,EuCSD1+CCS巨尾桉中检测到6株木质素含量比CK高,剩下两株Z-14和Z-16木质素含量比CK低;检测的3株EuCSD1+antiCCS巨尾桉中木质素含量均比CK低。暗示巨尾桉中CCS的过表达会增加木质素的生物合成,猜想CCS与巨尾桉中木质素的生物合成途径有关。