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γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,在动物、植物和微生物中均可发现GABA存在。GABA为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质,具有重要的生理功能,在医药、食品保健、化工、农业等行业有广泛的应用。利用微生物谷氨酸脱羧酶合成GABA的方法具有多种优点,受到国内外的关注与重视。本文对嗜热链球菌Y2的谷氨酸脱羧酶基因进行了系统的研究,主要围绕谷氨酸脱羧酶基因的克隆、序列分析、大肠杆菌表达载体的构建、枯草杆菌表达载体的构建进行探讨,成功地克隆出该基因,并实现了异源表达。1.通过已经在NCBI公布的几种细菌谷氨酸脱羧酶氨基酸序列进行对比分析,找出高度保守的氨基酸区段,利用CODEHOP在线分析工具设计出简并引物,从实验室保存的嗜热链球菌Y2基因组DNA中扩增出一段400bp左右的片段。将此片段插入pMD19-T后测序,在NCBI中用Blastx比对,搜索到的同源序列均为谷氨酸脱羧酶。再从该序列出发,设计引物,通过SiteFinding PCR进行染色体步行,扩增旁邻序列,向上、下游扩增的长度约800bp、1300bp,与pMD19-T连接后测序。将几个测序的结果拼接,得到一段2036 bp的DNA序列,提交到GenBank(登录号DQ871217)。其中存在一个1380bp的开放阅读框,在核酸水平上没有任何基因与该基因具有明显的同源性。用Blastx比对,发现其编码产物与多种细菌的谷氨酸脱羧酶存在同源性。SignalP软件分析表明该基因无信号肽。运用Vector NTI软件分析,该基因编码的蛋白质由459个氨基酸组成,分子量为52595.18 Da,N-末端序列为NH2-Met-Asn-Glu-Lys-Leu-Phe-Arg-Glu-Ile-,与从该菌株分离的天然谷氨酸脱羧酶N-末端序列一致,该基因就是谷氨酸脱羧酶的基因gadB。利用ClustalX 1.83与MEGA4构建了谷氨酸脱羧酶的系统发育树,与嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶最接近的是Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953,与肺炎链球菌的谷氨酸脱羧酶具有巨大差异。gadB基因上游的序列与多种细菌的转座酶基因同源,下游序列在基因水平上没有任何同源基因,在蛋白质水平上发现与多种细菌的谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向转运蛋白同源,推断为gadC基因。嗜热链球菌gadBC的排列顺序与大肠杆菌、弗氏志贺菌的一致,而与乳酸乳球菌、短乳杆菌的相反。2.设计引物Gad-f1、Gad-r1扩增嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因gadB,用NcoⅠ、EcoRⅠ切割gadB扩增产物,插入大肠杆菌载体pET-DsbA,获得非融合表达载体pET-gadB,转化E. coli BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE显示在含pET-gadB的重组大肠杆菌中有一条对照菌株没有的蛋白条带,用凝胶分析软件计算其分子量,约为47kDa,接近嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶的理论分子量52.6 kDa,也与从嗜热链球菌中分离纯化的谷氨酸脱羧酶在SDS-PAGE中的分子量47kDa一致。发酵液中的酶活力为45.4 mU/ml,是对照大肠杆菌的2.4倍,嗜热链球菌的2.1倍。设计引物Gad-f2.Gad-r2,扩增gadB基因,用BglⅡ切割gadB扩增产物,插入BamHI单酶切的pET-DsbA,获得融合表达载体pET-DsbA-gadB,转化E. coli BL21 (DE3) pLysS.发酵液中的酶活力为60.2 mU/ml,是对照大肠杆菌的3.2倍,嗜热链球菌的2.8倍。研究重组E. coli最佳诱导条件,得到最佳诱导时间为2h,IPTG的添加量为0.4mM,诱导温度为30℃。含pET-DsbA-gadB的大肠杆菌诱导表达后,用镍柱纯化带有组氨酸标签的融合蛋白DsbA-GAD, SDS-PAGE显示出单一条带,用凝胶分析软件计算出其分子量约为82kDa左右,与理论值77 kDa基本一致。将纯化的酶液与底物反应后,测得其活力为2.8 U/mg蛋白质。最适反应pH为4.2,最适反应温度为52℃。3.用HindⅢ、ClaⅠ切割大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pHB201,去掉其P59启动子、cat86::lacZa等功能区,再根据被切除的大肠杆菌Ori pUC复制起始序列设计两条互补引物,两端形成HindⅢ、ClaⅠ的粘性末端,与HindⅢ、ClaⅠ切割的pHB201连接,恢复大肠杆菌复制起始序列,得到pHB-hc。从枯草杆菌168基因组中分别扩增P43启动子、degQ基因、果聚糖蔗糖转移酶启动子PsacB及其信号肽编码序列SPsacB。用重叠延伸拼接法(SOE)将它们拼接成一个片段并在degQ后加上大肠杆菌trpA终止子序列,在两端加上ClaⅠ、XhoⅠ识别序列,获得的片段TtrpA-degQ-P43-PsacB-SPsacB用ClaⅠ、XhoⅠ双酶切,与经相同限制酶消化的pHB-hc连接,得到一个可被蔗糖诱导的枯草杆菌表达载体pHPQ.扩增谷氨酸脱羧酶基因gadB,在两端加上XhoⅠ识别序列,单酶切后插入pHPQ的XhoⅠ位置,得到pHPQ-gadB。从枯草杆菌168基因组DNA分别扩增P43启动子、degQ基因、degU基因,在degU基因后加上大肠杆菌trpA终止子,用重叠延伸拼接法扩增,两端加上ClaⅠ、BglⅡ识别序列,得到的片段TtrpA-degU-degQ-P43双酶切后插入到pHPQ-gadB的ClaⅠ、BglⅡ区域,替换掉TtrpA-degQ-P43,得到载体pHUQ-gadB.从枯草杆菌168基因组DNA分别扩增果聚糖蔗糖转移酶启动子PsacB、中性蛋白酶信号肽编码序列SPnprB,从嗜热链球菌Y2基因组DNA扩增谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过重叠延伸法将它们拼接成一个片段PsacB-SPnprB-gadB,两端加上BglⅡ、XhoⅠ识别序列,用这两个酶切掉pHUQ-gadB中的PsacB-SPsacB-gadB区域,换上PsacB-SPnprB-gadB,将获得的载体命名为pUQSN-gadB。将pHPQ-gadB、pHUQ-gadB、pUQSN-gadB分别转化B. subtilis WB800,重组菌液加入2%蔗糖诱导,检测发酵液上清重组酶的活力,pEPQ-gadB未检出,pHUQ-gadB的酶活力为2.6 mU/ml, pUQSN-gadB的酶活力为3.4 mU/ml.将发酵液浓缩后进行SDS-PAGE分析,pHPQ-gadB未出现目的蛋白条带,pHUQ-gadB、pUQSN-gadB出现目的蛋白条带,分子量约为47kDa,与理论值52.6kDa基本一致。