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哺乳动物中,SUMO(small ubiquitin-like modifier,小类泛素相关修饰物)作为重要的翻译后修饰存在于许多细胞过程中,它包括4种SUMO分子,SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4。其中SUMO-1参与细胞内蛋白质分解、细胞周期、细胞增殖、基因表达、细胞凋亡、DNA复制和修复、核质转运、信号转导和转录等生物学过程。SUMO化受E1、E2和E3酶的催化与底物蛋白结合而起作用。活性氧作为细胞外和细胞内不能缺少的信号分子,在细胞中会进行一系列的基因表达调控或者蛋白质转录翻译后修饰调控,它可以在结合或去结合水平上调节SUMO。然而在猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育过程中,SUMO化的分子机制还不清楚。因此,本研究的主要目的是探究SUMO化的E1激活酶UBA2、E2结合酶UBC9以及过氧化氢对猪卵母细胞体外成熟与凋亡、精-卵结合、孤雌激活和体外受精后胚胎发育的影响。本试验分为三部分,结果如下:试验一:类泛素化E1激活酶UBA2对猪卵母细胞体外成熟、凋亡及孤雌激活的影响1.不同直径卵泡中提取的卵母细胞蛋白进行类泛素化SUMO-1蛋白含量测定,直径小于3mm和3-6mm的卵母细胞蛋白中的SUMO-1蛋白含量显著地高于直径大于6mm的处理组。2.在卵母细胞体外成熟液中添加UBA2,提取成熟卵母细胞蛋白。在分子量约为67、96和123 ku处出现SUMO-1蛋白条带,10 μg/mL UBA2处理组SUMO-1蛋白含量显著升高。3.猪卵母细胞体外成熟培养液中添加UBA2后,10μg/mL UBA2处理组的卵母细胞成熟率显著升高。4.挑选优质卵丘细胞进行Annexin v-FITC/PI双染色,利用流式细胞仪检测卵丘细胞的凋亡情况,细胞的凋亡率分别为:3.50%、3.31%、0.66%和0.42%,经10 μg/mLUBA2处理后,极显著降低了细胞的凋亡。5.挑出优质成熟卵母细胞并提取RNA,利用RT-qPCR法分别检测凋亡相关基因,基因水平分为两种趋势,在5μg/mLUBA2处理组中,Bcl-2基因表达显著上调,而Bax基因显著下调,添加10μg/mLUBA2处理组中Caspase3基因显著下调。6.添加UBA2的卵母细胞成熟并孤雌激活后,5 μg/mL UBA2处理组的卵裂率显著升高,而10 μg/mL UBA2处理组囊胚率显著升高。试验二:类泛素化E2结合酶UBC9对猪卵母细胞体外成熟、凋亡及胚胎发育的影响1.在卵母细胞体外成熟液中添加UBC9,提取成熟卵母细胞蛋白。在分子量约为59和71ku处出现SUMO-1蛋白条带,10 μg/mL UBC9处理组SUMO-1蛋白含量显著降低。2.卵母细胞成熟培养液中添加UBC9培养成熟后,5μg/mL UBA2处理组的卵母细胞成熟率显著降低。3.挑选优质卵丘细胞进行Annexin v-FITC/PI双染色,利用流式细胞仪检测卵丘细胞的凋亡情况,细胞的凋亡率分别为:4.71%、15.96%、21.63%和25.79%,5μg/mL UBC9处理组显著促进细胞的凋亡,10和15 μg/mL UBC9处理组极显著促进细胞的凋亡。4.利用RT-qPCR法分别检测凋亡相关基因,在10μg/mLUBC9处理组中,Bcl-2基因表达显著下调。在添加5 μg/mL时Bax和Caspase3基因显著上调。5.卵母细胞体外成熟受精后,10 μg/mL UBC9处理组显著降低了胚胎的卵裂率。试验三:过氧化氢对猪卵母细胞类泛素化修饰及精-卵结合的影响1.在体外成熟培养液中添加不同浓度的H2O2,75 μg/mL H2O2处理组中,卵母细胞成熟率显著降低。可见,添加高浓度的H2O2降低了卵母细胞成熟率,而低浓度的H2O2对卵母细胞成熟率没有显著影响。2.在卵母细胞成熟培养液中添加不同浓度的H2O2,免疫印迹分析后,在18和77 ku处出现SUMO化标记,75μg/mL H2O2处理组的SUMO-1蛋白表达量显著降低,这些结果表明,H2O2对猪卵母细胞体外成熟中SUMO-1蛋白起抑制作用。3.添加不同浓度的H2O2培养44 h后,利用流式细胞仪检测卵丘细胞的凋亡情况。细胞的凋亡率分别为:6.26%,8.22%,22.85%,40.13%,43.45%,凋亡率逐渐增加,并且经75 μg/mL H2O2处理后,显著促进细胞的凋亡。4.添加不同浓度为H2O2后,挑出优质成熟卵母细胞并提取RNA,利用qRT-PCR法分别检测凋亡相关基因。结果在75 μg/mL H2O2处理组中,Bcl-2基因表达显著下调而Caspase3基因表达显著上调。Bax基因在50μg/mL H2O2处理组中显著上调。5.卵母细胞体外成熟培养液中添加H2O2后,75μg/mL H2O2处理组显著减少ZP溶解度。6.精-卵结合后,添加75μg/mL H2O2处理时蓝色荧光开始变少,显著减少了卵母细胞附着精子的数量。综上所述,UBC9、H2O2降低了猪卵母细胞体外成熟率、SUMO-1蛋白含量,增加了卵丘细胞凋亡以及凋亡基因的表达。并且,UBC9降低了体外受精后胚胎的发育,而H2O2延长了ZP溶解度,减少了卵母细胞附着精子的数量。UBA2提高了卵母细胞体外成熟率、SUMO-1蛋白含量以及孤雌激活后胚胎的发育,降低了凋亡基因的表达减少了卵丘细胞凋亡。本研究结果将为卵母细胞类泛素化修饰提供更多的理论基础,对日后的生殖生产提供更多的理论依据。