论文部分内容阅读
目的:本研究通过流行病学调查及实验室检测,研究氟暴露对人群细胞周期调控分子p21及DNA甲基化过程中的关键酶1(DNMT1)mRNA转录及蛋白表达的影响。构建人原代成骨细胞氟中毒模型,检测不同浓度氟对人原代成骨细胞p21基因启动子区甲基化水平及其mRNA转录及蛋白表达的影响,并检测染氟人原代成骨细胞DNMT1 mRNA转录及蛋白表达,以探讨p21基因甲基化水平改变在氟骨症发生发展中的作用。方法:1燃煤污染型氟中毒人群研究1.1调查对象的选择本研究按照GB 17018-2011地方性氟中毒病区划分标准,选择燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,无氟暴露的安顺市张官村作为对照点;根据有无氟暴露史、临床症状、体征及X线检查未见异常、有无氟斑牙形成等,共筛选出调查对象380例(氟中毒病例295例,对照85例)。1.2问卷调查和环境及生物样本采集在知情同意原则下,对调查对象进行问卷调查,并采集环境样本(大米、辣椒、玉米、饮水、菜土、粘土、煤及室内外空气)及生物样本(血样、尿样)。1.3环境介质和尿中氟含量检测及分组采用氟离子选择电极法检测环境样本及尿样中氟含量,并根据体内氟暴露水平(尿氟,UF)将调查对象分为4组:(1)UF<1.96 mg/gCr组140例,其中男性61例,女性79例,年龄(44±17)岁;(2)1.96 mg/gCr≤UF<3.92mg/gCr组93例,其中男性45例,女性48例,年龄(44±18)岁;(3)3.92mg/gCr≤UF<7.84mg/gCr组82例,其中男性44例、女性38例,年龄(45±16)岁;(4)UF≥7.84mg/gCr组65例,其中男性29例,女性36例,年龄(49±12)岁。1.4调查对象p21和DNMT1 mRNA转录及蛋白表达检测采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测调查对象外周血p21及DNMT1 mRNA转录表达;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测调查对象外周血P21及DNMT1蛋白表达。2氟中毒体外实验研究2.1人原代成骨细胞分离培养及鉴定采用酶消化法分离培养人原代成骨细胞,碱性磷酸酶染色(改良钙-钴法)及钙化结节染色(茜素红法)鉴定所培养细胞。2.2染氟人原代成骨生长曲线及细胞周期分布以0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L及1600μmol/L NaF剂量处理人原代成骨细胞后,采用MTT法检测染氟人原代成骨细胞生长曲线;以0μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L、1200μmol/L及1600μmol/L NaF剂量处理人原代成骨细胞后,采用流式细胞术检测染氟人原代成骨细胞周期分布。2.3建立人原代成骨细胞氟中毒模型以0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L及1000μmol/L NaF剂量处理人原代成骨细胞72h,通过形态学观察,碱性磷酸酶活性(PNPP法)及骨钙素含量(ELISA)确认人原代成骨细胞氟中毒模型的建立。2.4染氟人原代成骨细胞p21基因甲基化检测以0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L及1000μmol/L NaF剂量处理人原代成骨细胞72h后,采用硫化测序PCR法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测p21基因启动子区甲基化水平。2.5染氟人原代成骨细胞p21和DNMT1 mRNA转录及蛋白表达检测采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测p21及DNMT1 mRNA转录表达;免疫印迹法(Western-blotting,WB)检测P21及DNMT1蛋白表达。结果:1燃煤污染型氟中毒人群研究1.1环境介质及尿样中氟含量调查点大米、辣椒、玉米、饮水、菜土、煤室内外空气中氟含量均不同程度超过国家标准或推荐参考值,且明显高于相应对照区环境介质氟含量(P均<0.05)。与对照组比较,病例组UF浓度明显高于对照组(T=40470.40,P<0.05)。病例组内不同性别年龄组间比较,随着年龄增加,UF浓度逐渐增高(x2=18.21,P<0.05);女性UF浓度稍高于男性(T=25188.50,P<0.05)。1.2调查对象pp2211及DNMT1 mRNA转录及蛋白表达各UF浓度组间比较,p21mRNA转录及蛋白表达差异具有统计学意义(Fp21 mRNA转录表达=10.32,FP21蛋白表达=3.62,P均<0.05);且随UF浓度增加p21 mRNA转录及蛋白表达逐渐降低(rp21mRNA转录表达=﹣0.10,rP21蛋白表达=﹣0.16,P均<0.05)。各UF浓度组间比较,DNMT1 mRNA转录及蛋白表达差异具有统计学意义(FDNMT1 mRNA转录表达=6.66,FDNMT1蛋白表达=3.11,P均<0.05);且随着UF水平增加DNMT1 mRNA转录表达逐渐增强(r=0.17,P<0.05);随UF浓度增加未观察到DNMT1蛋白表达呈剂量-效应关系。2氟中毒体外实验研究2.1人原代成骨细胞分离培养及鉴定消化分离的细胞培养24h后贴壁,呈梭形或圆形;随着细胞生长,长梭形细胞增多,呈成骨细胞形态;细胞生长融合后,呈漩涡状或放射状生长;碱性磷酸酶染色及钙化结节染色均呈阳性;结果鉴定所分离培养细胞为成骨细胞。2.2染氟人原代成骨细胞生长曲线及增殖率测定染氟72h内,100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L及800μmol/L剂量组细胞数随染氟时间延长呈连续性增加趋势,染氟96h后各剂量组细胞数明显减少,1600μmol/L剂量组随染氟时间的增加呈连续性减少趋势;相同时间点、不同剂量组相比较,染氟48h、72h后,100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L及800μmol/L剂量组增殖率均显著高于对照组(P均<0.05);1600μmol/L剂量组增殖率则低于其他各组(P均<0.05);染氟96h后,各剂量组OD值均低于对照组。2.3染氟人原代成骨细胞周期分布染氟72h后,在1000μmol/L NaF剂量内,随NaF剂量增加处于G0/G1期细胞数减少,而S期细胞数逐渐增多,同时增殖指数也逐渐升高;1000μmol/L剂量组S期细胞及增殖指数明显高于其他剂量组,差异有统计学意义(P均<0.05),表现出增殖旺盛状态。2.4人原代成骨细胞氟中毒模型的建立显微镜下观察人原代成骨细胞随NaF剂量增加,细胞密集程度增加,同时细胞形态发生改变;AKP活性及BGP含量随NaF剂量增加而增加(FAKP=77.40,FBGP=11.26,P均<0.05),说明本实验条件下氟对人原代成骨细胞增殖活性及代谢活力增强,成功构建了人原代成骨细胞氟中毒模型。2.5染氟人原代成骨细胞p21基因启动子区甲基化水平以0μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L及1000μmol/L NaF处理人原代成骨细胞72h后,p21基因启动子区甲基化水平分别为0%(0/288)、0.7%(2/288)、3.8%(11/288)、11.8%(34/288)及17.7%(51/288),各组间差异具有统计学意义(χ2=107.368,P<0.05);随染氟剂量增加,p21基因启动子区甲基化水平逐渐增加(χ趋2=96.273,P<0.05)。2.6染氟人原代成骨细胞p21和DNMT1 mRNA转录及蛋白表达各剂量组p21mRNA转录及蛋白比较差异具有统计学意义(Fp21 mRNA转录表达=3.90,FP21蛋白表达=22.18,P均<0.05);各剂量组DNMT1 mRNA转录比较差异具有统计学意义(F=3.43,P<0.05)。随NaF剂量增加,人原代成骨细胞p21 mRNA转录及蛋白表达逐渐降低(rp21 mRNA转录表达=﹣0.761,rP21蛋白表达=﹣0.949,P均<0.05);DNMT1mRNA转录及蛋白表达逐渐增加(rDNMT1 mRNA转录表达=0.658,rDNMT1蛋白表达=0.720,P均<0.05)。结论:(1)体内外研究表明氟可致p21 mRNA转录及蛋白表达降低,有可能引起成骨细胞由G1快速进入S期,使成骨细胞增殖活跃。(2)氟致人原代成骨细胞p21基因启动子区甲基化可抑制其mRNA转录和蛋白表达,是氟骨症发生的分子机制之一。(3)氟可致DNMT1 mRNA转录及蛋白表达增强,参与了人原代成骨细胞p21基因启动子区高甲基化过程。