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本研究前期获得一株高效降解羽毛的菌株。该菌株在以羽毛为底物的基础培养基中进行发酵,48 h内便能将完整羽毛全部降解。其降解能力明显好于已报道的相关菌株。通过生化和分子方面的鉴定,确定该菌株的种属;利用扫描电镜对羽毛降解过程进行了观察,同时测定了发酵产物中氨基酸的种类和含量以及三种含硫化合物的含量变化;通过离子交换层析和质谱鉴定技术,对发酵过程中参与羽毛降解的相关水解酶进行了分离纯化;利用无缝克隆技术,对纯化得到的角蛋白水解酶进行了基因克隆和原核表达,并以羽毛粉为底物,验证了相关酶的角蛋白水解活性。从硫解和酶解方面对该菌株的角蛋白水解机制进行了初步分析,为羽毛废弃资源的微生物再利用提供一定的理论指导。主要研究结果如下:1.高效降解羽毛菌株的鉴定。通过形态学和生理生化特性研究,结合16SrDNA序列分析,确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),命名BS8。以羽毛、鱼鳞、头发等作为底物发酵,结果显示该菌株对硬蛋白类都有不同程度的降解能力,其中羽毛降解效果最为明显。2.Bacillus subtilis 8对羽毛角蛋白的降解机理研究。Bacillussubtilis8以羽毛作为唯一碳氮源进行发酵,羽毛降解效率随着发酵时间的延长逐渐增大。在24 h和48 h时检测到最大二硫键还原酶酶活(9.6 U/mL)和最大角蛋白酶活性(21.6 U/mL),表明酶解作用参与了羽毛的降解。接种BS8后,培养基中出现亚硫酸盐,且含量缓慢升高,同时伴随着磺酸半胱氨酸(CySO3H)以及巯基类化合物的生成,证实羽毛降解过程中存在硫解作用。发酵液中大量NH3的生成以及培养基pH值的升高现象,表明羽毛的降解过程还伴随着硫化物的转氨基、脱氨基作用。3.Bacillus subtilis8胞外蛋白酶的分离纯化和质谱鉴定。利用DEAE Sepharose FastFlow阴离子交换层析与明胶活性染色相结合,成功获得4个目的蛋白条带。经LC-MS/MS匹配结果,结合蛋白分子量大小、GO功能注释及相关文献报道,筛选到4种与本实验相吻合的蛋白酶,分别为分子量33.9kD的丝氨酸蛋白酶(Serine protease;EC:3.4.21)、45.6 kD 的肽酶 T(Peptidase T;EC:3.4.11)、64.3 kD 的膜结合的 γ-谷氨酰转肽酶(Membrane bound gamma-glutamyltransferase;EC:2.3.2.2)和 40.7 kD 的胱硫醚 γ-裂合酶(Cystathionine gamma-synthase;EC:4.4.1.1),分别命名为 Ser P、PetT、M-y-Glu和Cys P。功能注释结果表明4种蛋白酶分别属于水解酶类(Ser P、PetT)、转移酶类(M-γ-Glu)和裂解酶类(CysP),具有断裂蛋白质的肽键、碳硫键,转氨基、脱氨基功能。4.Bacillus subtilis8胞外蛋白酶的基因克隆和原核表达。以BS8基因组为模板,根据SerP、CysP、M-y-Glu、PetT基因序列设计特异引物成功扩增出各蛋白酶全长基因,分别为960 bp、1143 bp、1776 bp、1233 bp。采用无缝连接技术构建表达载体,并在E.coli BL21中成功表达,大小与预期相符。重组表达载体分别命名P-Ser、P-Cys、P-Glu、P-Pet。以羽毛粉为底物测定各重组蛋白酶活性时发现,4种重组酶均具有一定的角蛋白水解活性,但活力差异较大。其中,P-Cys的角蛋白酶活性最高,为102.4U/mL;而只有P-Ser分别具有角蛋白酶活性(58.6U/mL)和较低的二硫键还原酶活性(14.1 U/mL)。打开二硫键是降解羽毛角蛋白的关键,因此推测P-Cys和P-Ser可能是Bacillus subtilis 8降解羽毛的两种关键蛋白酶。5.在不同蛋白酶组合中,P-Ser对P-Glu、P-Pet、P-Cys水解天然羽毛具有一定的促进作用。其中4种蛋白酶混合后,角蛋白酶和二硫键还原酶活性达到最大,且该组合对天然羽毛的水解效果最明显。但总体来看,羽毛的酶解作用并不显著,综合表明,BS8的羽毛角蛋白降解以硫解为主。