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研究背景与目的醋酸甲地孕酮（megestrol acetate,MA）是一种高效的17α-羟孕酮衍生物,是子宫内膜癌患者保守治疗的重要选择之一。有研究报道,醋酸甲地孕酮可通过调控激素功能的方式发挥抗肿瘤作用,尽管如此,醋酸甲地孕酮在子宫内膜癌（endometrial cancer,EC）治疗中的确切作用和机制仍不清楚。已知孕激素受体（progesterone receptor,PR）是孕激素类物质发挥作用的主要介导者,孕激素与其受体的相互作用对于细胞的生理功能变化具有调控作用。那么,孕激素受体在正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达情况如何?是否参与介导MA对子宫内膜癌的抗肿瘤作用?具体是何种受体亚型发挥功能?其所涉及的具体细胞与分子机制是否与子宫内膜癌细胞功能活性的改变相关?上述问题的解答对于进一步理解子宫内膜癌的发病机理以及深入探析MA在子宫内膜癌治疗中的抗肿瘤作用具有重要指导意义。我们构建了子宫内膜癌细胞移植瘤小鼠及细胞模型,拟分析正常及病理条件下不同孕激素受体亚型的表达情况,通过体内外实验证实MA对于子宫内膜癌的治疗作用,并对其所涉及的潜在细胞与分子机制进行研究。旨在为深入理解MA抑制子宫内膜癌的作用机制提供实验依据。研究方法利用生物信息学的方法通过GEPIA网站获取和分析TCGA和GTEx癌症基因组数据,分析PR在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌患者组织中的表达水平以及在不同分期子宫内膜癌肿瘤组织中的表达水平;利用Kaplan-Meier法分析PR表达与患者总生存期（Overall Survival,OS）和无病生存期（Diseases Free Survival,DFS）的关系。收集子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织样本各20例,并体外培养EC细胞系Ishikawa、HHUA和正常子宫内膜上皮细胞hEEC,western blotting检测不同组织及各细胞系中PR亚型PR-A、PR-B的表达。将Ishikawa细胞注射于裸鼠背部皮下建立荷瘤小鼠,western blotting检测移植瘤中PR-A、PR-B的表达变化。以不同浓度MA（1 nM、10 nM和100 nM）分别处理子宫内膜癌细胞Ishikawa和HHUA,CCK8实验检测不同时间点各组细胞活力。构建PR-A siRNA、PR-B siRNA以及PR-A过表达慢病毒载体、PR-B过表达慢病毒载体,分别转染/感染Ishikawa和HHUA细胞,同时给予10 nM MA处理,观察MA对各组细胞活力的影响。使用Ishikawa细胞建立荷瘤小鼠,给予不同剂量MA处理,检测荷瘤鼠肿瘤组织体积和重量的变化。使用PR-A过表达慢病毒和PR-B过表达慢病毒分别感染Ishikawa细胞系,建立稳定过表达PR-A及PR-B的Ishikawa细胞系,并建立荷瘤小鼠,观察MA处理对各组小鼠肿瘤组织体积和重量的影响。分别以10 nM的MA处理子宫内膜癌细胞Ishikawa、HHUA 72 h、96 h,流式细胞仪检测细胞凋亡情况和周期变化,β-半乳糖苷酶染色试剂盒（SA β-Gal Staining Kit）染色检测细胞衰老,western blotting检测周期和衰老相关分子Cyclin D1,p16和p21表达。收集子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织,免疫组化染色检测不同组织中p21的表达。PR-B siRNA分别转染子宫内膜癌细胞Ishikawa、HHUA并使用10 nM MA处理细胞,采用SAβ-Gal染色观察细胞衰老情况。利用生物信息学的方法通过GEPIA数据库获取和分析EC组织中PR与叉头框蛋白O1（Forkhead Box O1,FOXO1）表达的相关性,并利用Kaplan-Meier分析FOXO1表达与患者总生存期和无病生存期的相关性。以10 nM的MA处理Ishikawa和HHUA细胞,分别采用RT-PCR和western blotting检测各细胞系中FOXO1 mRNA和蛋白质的表达,细胞免疫荧光染色观察FOXO1的表达和定位。应用免疫组化检测子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中FOXO1的表达。使用Ishikawa细胞建立荷瘤小鼠,并给予MA处理,免疫组化染色观察荷瘤小鼠瘤体组织中FOXO1的表达和定位。使用FOXO1抑制剂AS184285预处理子宫内膜癌细胞Ishikawa、HHUA 1 h,给予10 nM MA处理96 h,CCK8检测各组细胞活力,SAβ-Gal染色检测细胞衰老情况,western blotting检测细胞衰老相关蛋白的表达。FOXO1抑制剂预处理子宫内膜癌细胞Ishikawa、HHUA 1 h后,给予PR-B siRNA转染或PR-B过表达慢病毒感染,然后使用10 nM MA处理各组细胞96 h,CCK8检测各组细胞活力,SAβ-Gal染色检测细胞衰老情况,western blotting检测细胞衰老相关蛋白的表达,分析FOXO1信号通路在MA抑制子宫内膜癌中的作用。研究结果利用GEPIA和Linkedomics分析TCGA-UCEC数据集中孕激素受体PR在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中基因水平的差异,数据显示:正常组织PR的中位表达量为35.05,肿瘤组织中为3.235,差异具有统计学意义（P＜0.001）。分析PR表达与患者临床特征的关系,发现PR在不同病理分期EC患者中的表达差异具有统计学差异（F=6.81,P＜0.001）,PR随着临床分期的升高而表达逐步降低。将患者以PR中位表达做为Cut-off值分为PR高表达组和PR低表达组,Kaplan-Meier分析显示PR高表达组患者的10年OS约为70%,而PR低表达组患者10年OS为20%左右,两者差异有统计学意义（Logrank P=0.0042）。PR高表达组患者的DFS显著高于PR低表达组,差异有统计学意义（Logrank P=0.0028）。与正常子宫内膜组织样本相比,EC组织中PR-A显著降低,PR-B显著升高,PR-A/PR-B的比值显著降低（P＜0.05）。PR-A、PR-B在hEEC以及EC细胞中均有表达。与hEEC细胞相比,子宫内膜癌细胞Ishikawa、HHUA中PR-A显著降低,而PR-B显著升高,PR-A/PR-B的比值降低（P＜0.05）。Ishikawa细胞裸鼠移植瘤组织中PR-A的表达量随着肿瘤形成时间的延长逐步降低,而PR-B的表达量则呈上升趋势,PR-A/PR-B的比值显著降低（P＜0.05）。不同浓度MA处理Ishikawa、HHUA后,CCK8检测结果显示,与正常对照组相比,1 nMMA处理后两细胞细胞活力无显著改变;而10 nM、100 nMMA处理后,Ishikawa、HHUA细胞活力均显著下降（P＜0.05）。Ishikawa和HHUA细胞转染PR-A siRNA或PR-B siRNA后,细胞活力也无明显改变。采用10 nM MA 处理转染 PR-A siRNA、PR-B siRNA或相应对照 siRNA 的 Ishikawa 和 HHUA细胞,结果发现:与对照siRNA转染组相比,PR-A siRNA及PR-BsiRNA转染组中,MA对细胞活力的抑制作用被消除。与DMSO组相比,PR-A过表达组及PR-B过表达组的Ishikawa、HHUA细胞活力均下降;MA处理12h,24h,48h时,PR-A过表达或PR-B过表达组的细胞活力无明显变化;MA处理72h及96h后,PR-A过表达或PR-B过表达组的细胞活力显著下降（P＜0.05）。给予荷瘤小鼠50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg MA灌胃处理,结果显示,与对照组相比,50mg/kg MA处理组小鼠肿瘤体积和重量无明显变化;而100mg/kg和200mg/kg MA处理后,肿瘤体积显著减小,重量显著降低（P＜0.05）。与对照慢病毒感染的Ishikawa细胞荷瘤组小鼠相比,PR-A过表达组（OE-PR-A）、PR-B过表达组（OE-PR-B）的移植瘤体积和重量无明显变化;而100mg/kg MA处理PR-A过表达组或PR-B过表达组荷瘤小鼠后,与MA处理的对照慢病毒感染组小鼠相比,PR-B过表达组小鼠肿瘤的体积和重量均明显降低（P＜0.05）,而PR-A过表达组MA对移植瘤生长的抑制能力无明显变化。正常Ishikawa细胞和HHUA细胞凋亡率分别为（1.51 ±0.11）%和（1.23±0.09）%。应用MA处理后,细胞凋亡率升高,但与正常细胞相比,差异无统计学意义。与对照组相比,MA处理72 h和96 h后,Ishikawa和HHUA细胞周期发生阻滞,G1期细胞比例显著增加（P＜0.05）;10 nM MA处理显著下调Ishikawa和HHUA细胞中细胞周期相关蛋白Cyclin D1的表达水平（P＜0.05）;10 nM MA处理Ishikawa和HHUA细胞96 h能显著增加Ishikawa和HHUA细胞中SAβ-Gal阳性细胞数目（P＜0.01）,并显著提高细胞内衰老标志分子p21和p16的表达水平（P＜0.05）。采用MA处理PR-B siRNA转染组子宫内膜癌细胞,发现PR-B siRNA干扰后显著减弱MA对子宫内膜癌细胞衰老的诱导作用（P＜0.05）。生物信息学分析进一步显示EC患者肿瘤组织中PR与FOXO1表达有较强的相关性（R=0.4,P＜0.001）,FOXO1高表达组和FOXO1低表达组患者10年DFS 约为 63%和 45%（Logrank P=0.017）,两组 OS 接近（Logrank P=0.34）。免疫组化结果显示与正常组织相比,FOXO1在EC组织中的阳性率显著下降。MA处理后,Ishikawa和HHUA细胞中FOXO1转录和表达较对照组均显著增高（P＜0.05）;抑制或过表达PR-B影响MA对EC细胞的抑制作用及其对FOXO1的诱导作用。以FOXO1抑制剂AS184285及MA处理共同处理细胞,与MA处理组相比,AS184285预处理显著减弱MA对Ishikawa、HHUA细胞活力的抑制作用（P＜0.05）,AS184285处理组SAβ-Gal阳性细胞数目减少,细胞内p21和p16蛋白显著降低（P＜0.05）。结论醋酸甲地孕酮可通过PR-B介导,调控胞内FOXO1信号通路的活化水平,进而阻滞子宫内膜癌细胞的周期进程,诱导细胞衰老的发生。