论文部分内容阅读
牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的接触性传染病,在全球分布广泛,危害严重。关于BVDV导致的持续性感染和免疫抑制发生的分子机制,尤其是BVDV与宿主细胞之间相互作用关系尚没有系统性的阐述。mi RNAs是生物体内在转录后水平上调控基因表达的关键分子,由于其途径的专一性强以及效果明显等特点,mi RNAs及其靶位点已经成为治疗病毒性疾病的特效基因药物设计的新亮点。本实验室高通量测序检测了BVDV感染靶细胞MDBK后的mi RNAs差异表达谱显示:23个mi RNAs的表达量显著性升高;而通过生物学软件预测得到三个靶向BVDV NADL全基因组的mi RNAs,所以本研究以筛选出来的影响BVDV复制的mi RNAs为研究对象,探究mi RNAs影响BVDV-NADL复制的分子机制,进而为阐述BVDV的持续性感染的分子机制,BVDV防控新方法奠定理论基础。[目的]本研究以BVDV NADL为研究对象,根据BVDV NADL感染宿主细胞MDBK后mi RNAs的差异探索mi RNAs影响BVDV NADL复制的分子机制。(1)探究bta-mi R-33a靶向MDBK细胞中BCL凋亡通路中bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)基因从而影响BVDV NADL复制的机制;(2)探究bta-mi R-302c靶向BVDV NADL NS5A基因从而影响BVDV NADL复制的机制;[方法](1)依据本实验室前期高通量测序结果筛选合成22个mi RNAs,转染MDBK细胞后感染BVDV NADL,筛选出抑制BVDV NADL复制的mi RNAs;q RT-PCR扩增BVDV NADL E0基因的标准曲线;(2)生物学信息软件预测bta-mi R-33a的靶基因并用双荧光素酶报告基因系统验证;q RT-PCR、Western blot、流式细胞仪等方法检测bta-mi R-33a的靶基因bim蛋白的表达水平及凋亡率的变化;q RT-PCR检测bta-mi R-33a对BVDV NADL拷贝数的影响;构建带有绿色荧光蛋白标记的bim基因过表达慢病毒载体;q RT-PCR、Western blot、流式细胞仪等方法检测MDBK过表达bim基因后bta-mi R-33a的靶基因bim蛋白的表达水平及凋亡率的变化;q RT-PCR检测MDBK细胞过表达bim基因后bta-mi R-33a对BVDV NADL拷贝数的影响;(3)生物学信息软件预测靶向BVDV NADL全基因组的mi RNAs并用双荧光素酶报告基因系统验证;q RT-PCR检测bta-mi R-302c、bta-mi R-205、bta-mi R-497对BVDV NADL拷贝数和对TCID50的影响;q RT-PCR、Western blot检测感染BVDV NADL不同时间段后MDBK细胞中JAK-STAT通路中各个因子的表达水平变化;q RT-PCR、Western blot检测BVDV NADL感染和/或bta-mi R-302c转染不同时间段后,MDBK细胞中JAK-STAT通路中各个因子的表达水平变化。[结果](1)bta-mi R-33a、bta-mi R-27a-5p、bta-mi R-21*可以显著的降低BVDVNADL的复制水平;成功构建BVDV NADL E0基因的标准曲线;(2)bta-mi R-33a特异性靶向MDBK细胞中凋亡通路中bim基因3’非翻译区(untranslated region,UTR);bta-mi R-33a通过沉默bim基因的表达降低MDBK的凋亡率;bta-mi R-33a通过靶向bim基因降低BVDV NADL的拷贝数;成功构建过表达bim的慢病毒;bta-mi R-33a转染下调bim基因过表达的MDBK细胞中的bim蛋白表达水平;bta-mi R-33a能特异性降低bim基因过表达的MDBK细胞中BVDV NADL的拷贝数;(3)bta-mi R-302c特异性的靶向BVDV NADL的NS5A 3’端;bta-mi R-302c和bta-mi R-205下调BVDV NADL E0的m RNA水平,bta-mi R-497上调BVDV NADL E0的m RNA水平;随着感染BVDV NADL的时间的增长,JAK-STAT通路中各个因子的表达水平逐渐升高;bta-mi R-302c抑制JAK-STAT通路中各个因子的表达水平;[结论]:bta-mi R-33a负向调控细胞凋亡通路中Bcl-2-L11蛋白家族中的bim蛋白,抑制MDBK细胞凋亡,使BVDV不能扩散,从而抑制了BVDV的复制;bta-mi R-302c靶向BVDV NADL NS5A的3’端,间接地调控JAK-STAT通路,诱导细胞产生抗病毒蛋白,激发抗病毒机制,抑制BVDV NADL复制。