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水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)由褐飞虱为介体传播,其为纤细病毒属成员,自1963年首次于菲律宾确认以来多次在东南亚大面积发生。最近一次大面积发生于2006年-2009年越南湄公河三角洲区域的省份,导致此区700,000吨的稻米损失以及出口暂停,并在我国东南若干省份有局部发生。感染RGSV的水稻常呈现分蘖增多、植株矮化、叶片退绿且出现条纹、叶片变细、抽穗不完全及谷粒干瘪等症状,导致大多数受感染水稻几乎颗粒无收。因此,给我国及东南亚水稻种植带来严重的损失及潜在的威胁。DNA甲基化为表观遗传的一种重要方式,也是基因表达与调控的一种重要方式。植物DNA甲基化与植物的抗逆性反应、生长发育、基因组的维持、外来基因的防御和沉默、转座子抑制等重要生理过程关系密切,对甲基化进行影响,植株的表型通常会出现明显的异常。因此,对这些甲基化相关基因进行功能分析有重要的科研意义。关于水稻DNA重新甲基化酶突变体的实验显示,该突变体DNA甲基化的程度降低,并在营养生长及生殖生长期均表现出异常,表现为植株矮化、抽穗延迟、完全不育等症状。这些症状中的大多数与用5-氮胞苷处理水稻种子抑制DNA甲基化后长出的水稻表现出的症状以及水稻草状矮化病的症状相似。本实验相关的前期研究通过分析基因组DNA甲基化高通量测序数据、感染RGSV水稻甲基化总体情况数据以及感染RGSV水稻的转录组数据,初步得出在感染RGSV的水稻中,许多DNA甲基化相关基因的甲基化程度下降及表达量发生显著变化。本研究主要针对一些由于感染RGSV而导致甲基化程度下降及表达量发生显著变化的DNA甲基化相关基因的功能进行分析与验证,以进一步深入研究RGSV导致分蘖增多等症状的致病机制。本研究根据本实验室相关的前期研究结果,选出一批感染RGSV后甲基化程度下降及表达量显著变化的DNA甲基化相关基因,通过进一步分析与筛选,找出3个RGSV侵染后表达量变化大,且NCBI推测症状直接或间接与分蘖增多有关的甲基化相关基因:OsMET04、OsMET07以及OsME712。首先使用qPCR进一步验证感染RGSV水稻中这三个目的基因的表达量变化,之后构建相应的植物过表达及RNA干扰载体。实验期间研究并改良了一种基于农杆菌转化法的水稻遗传转化方法,此方法在维持原有方法的效率与速度的基础上,增加了愈伤产量,并进一步优化了洗菌的步骤,开发出了农杆菌洗菌液以及引入了抗真菌的有效方法,使洗菌不彻底及真菌污染的概率下降50%-70%。采用以上优化的水稻遗传转化体系,获得了OsMET04 OsMET07以及OsMET12的过表达转基因植株及OsMET07和OsMET12的RNA干扰植株。OsMET04的RNA干扰植株经过三次遗传转化均无法成功获得,推测可能对此基因的干扰会导致转基因水稻致死或无法分化。通过对转基因植株进行抗性基因PCR验证,筛选出阳性植株,与同时期的正常水稻相比,转靶基因OsMET07、OsMET12的植株未观察到有明显差异。而转OsMET04基因的转基因水稻出现明显的分蘖增多、植株矮化及低结实率等症状,这些症状与抑制DNA甲基化或感染RGSV出现的重要症状基本相同。用荧光定量PCR,选取水稻内源表达恒定的GADPH基因作为内参,对出现表型的OsMET04过表达转基因植株的目的基因进行表达量的定量分析,其表达量平均上升152倍。此实验结果初步证明RGSV抑制了水稻DNA甲基化,引起了分蘖增多以及可能是连带出现的矮化以及结实率低等症状,为后期的深入研究奠定基础。