牛乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的检测

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本文旨在建立准确、灵敏、简便的检测β-酪蛋白的方法,以此来衡量体外培养乳腺细胞的生理功能及分化状态。同时为在细胞水平上研究不同激素对酪蛋白表达调控、乳腺特异性表达载体的评价等相关研究提供有力的手段。用牛β-酪蛋白(纯度90%以上)免疫新西兰大白兔,获得兔抗牛β-酪蛋白多克隆抗体,经双向琼脂扩散检测其效价为1:32,并通过免疫印迹方法验证其为β-酪蛋白特异性抗体。建立了β-酪蛋白在蛋白水平及转录水平的检测方法。在蛋白水平上,利用所获得的抗体,建立了检测β-酪蛋白的ELISA方法。并比较了双抗夹心ELISA方法和间接竞争ELISA方法,实验结果显示,双抗夹心ELISA方法的灵敏度达10ng/ml,间接竞争ELISA方法的灵敏度达150ng/ml左右。相比较而言,双抗夹心ELISA方法灵敏度更高,方法更简便。在转录水平,利用所合成的β-酪蛋白引物,建立了RT-PCR检测β-酪蛋白的方法。应用双抗夹心ELISA方法和RT-PCR方法,我们均检测到了从牛初乳中分离的乳腺上皮细胞中的β-酪蛋白。应用上皮细胞特异蛋白角蛋白18单克隆抗体,对体外培养的乳腺上皮细胞进行鉴定。结果呈阳性,证明所建细胞系具有乳腺上皮细胞特性。β-酪蛋白的表达必须通过包括促乳素在内的激素诱导,在实验中,我们尝试了应用促乳素、胰岛素和糖皮质激素对实验室建立的体外培养的牛乳腺上皮细胞系进行激素诱导,并通过建立的方法对其中的β-酪蛋白进行检测。但是未在此细胞系中检测到β-酪蛋白。
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