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目的通过建立大鼠和细胞体内外自然衰老模型,研究内质网氧化应激对线粒体自噬及衰老的调控作用,并阐明其中可能的分子机制。方法1.造模:选择3月龄和24月龄SD大鼠建立自然衰老模型;选择人源细胞系HUVEC和WI38细胞自然传代至50代,建立复制性细胞衰老模型。2.基因操作干预关键靶分子:通过感染慢病毒过表达抗氧化酶GPx8建立过表达GPx8细胞系;通过感染慢病毒包装的Parkin sh RNA建立敲减Parkin细胞系。3.衰老指标检测:采用试剂盒检测细胞β-Gal染色及活性;采用Q-PCR和Western Blot方法检测大鼠及细胞衰老标志物p21、p16、p27 m RNA和蛋白水平;采用CCK8试剂盒检测细胞增殖活力。4.GPx8水平检测:采用Q-PCR和Western Blot方法检测大鼠及细胞内质网关键抗氧化酶GPx8 m RNA和蛋白水平。5.内质网H2O2水平检测:采用ER-Hyper腺病毒感染细胞和内质网标记探针ER Tracker共定位,通过共聚焦荧光成像检测细胞内质网H2O2。6.细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的敏感性检测:采用衣霉素处理细胞,通过试剂盒检测细胞ERS的敏感性。7.自噬水平检测:采用Western Blot方法检测自噬LC3和p62蛋白水平。8.线粒体自噬水平检测:采用GFP-LC3腺病毒感染细胞和线粒体标记探针Mito Tracker共定位,通过共聚焦荧光成像检测细胞线粒体自噬水平;采用试剂盒提取线粒体DNA(mt DNA),并进行荧光定量PCR方法检测细胞内线粒体DNA拷贝数;采用Western Blot方法检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、Nix和FUNDC1水平。结果1.大鼠衰老过程中,肝组织内质网关键抗氧化酶GPx8水平降低。衰老标志物检测结果显示,大鼠自然衰老。Q-PCR和Western Blot结果显示大鼠衰老过程中,肝组织内质网抗氧化酶GPx8 m RNA和蛋白水平显著降低,提示内质网抗氧化酶GPx8可能参与了衰老过程。2.细胞衰老过程中,内质网氧化应激水平增加,细胞ERS的敏感性降低,自噬受到抑制。衰老标志物检测结果显示,细胞复制衰老模型建立成功。Q-PCR和Western Blot结果共同显示,细胞衰老过程中,内质网抗氧化酶GPx8 m RNA和蛋白水平显著降低。同时ER-Hyper结果显示,内质网H2O2水平升高。表明衰老过程中发生了内质网氧化应激。细胞ERS的敏感性检测结果显示,细胞衰老过程中,细胞ERS的敏感性降低。此外,Western Blot结果显示,细胞衰老过程中,LC3-II/LC3-I降低,p62水平升高,自噬水平受到抑制。提示内质网氧化应激增加可能通过抑制细胞自噬导致细胞衰老。3.过表达GPx8抑制内质网氧化应激,提高了细胞自噬,缓解了细胞衰老。ER-Hyper结果显示,过表达GPx8后,内质网H2O2水平降低,氧化应激水平受到抑制。Western Blot结果显示,过表达GPx8后,LC3-II/LC3-I升高,p62蛋白水平降低,自噬水平提高。衰老标志物检测结果显示,过表达GPx8后,β-Gal显色减少、活性降低,细胞增殖活力升高,细胞衰老标志物p21 m RNA水平降低,细胞衰老得到缓解。表明内质网氧化应激可以抑制细胞自噬,促进细胞衰老。4.采用UPR通路特异性抑制剂抑制UPR通路活性,降低细胞ERS的敏感性,能够拮抗过表达GPx8对自噬水平的改善以及对衰老的缓解作用。细胞ERS的敏感性检测结果显示,过表达GPx8后ERS的敏感性升高。而给予UPR通路抑制剂后则明显降低。线粒体自噬水平检测结果显示,过表达GPx8后,线粒体自噬水平升高。而给予抑制剂后则线粒体自噬相关蛋白Parkin和PINK1水平降低,mt DNA水平升高,GFP-LC3与线粒体融合部分减少,线粒体自噬水平受到抑制。衰老标志物检测结果显示,过表达GPx8后,细胞衰老得到缓解。而给予抑制剂后则衰老标志物β-Gal显色增加、活性升高,细胞增殖活力降低,细胞衰老标志物p21、p27和p16 m RNA水平升高,细胞衰老加剧。表明改善内质网氧化应激缓解衰老是通过活化UPR通路,促进细胞自噬。5.敲减线粒体自噬关键蛋白Parkin抑制线粒体自噬水平,能够阻断过表达GPx8对自噬水平的升高以及对衰老的缓解作用。过表达GPx8再敲减线粒体自噬关键蛋白Parkin后,Parkin和PINK1蛋白水平显著降低,mt DNA水平明显升高,GFP-LC3与线粒体融合部分减少,线粒体自噬水平受到抑制。衰老标志物检测结果显示,线粒体自噬被抑制后衰老标志物β-Gal显色增加、活性升高,细胞增殖活力降低,细胞衰老程度加剧,GPx8过表达带来的缓解衰老作用消失。提示改善内质网氧化应激缓解衰老是通过提高线粒体自噬水平。结论1.衰老过程中,伴随着内质网氧化应激升高,细胞UPR活性降低,细胞ERS的敏感性降低,线粒体自噬水平下降。2.改善内质网氧化应激可以提高细胞UPR活性,增加细胞ERS的敏感性,促进线粒体自噬,缓解细胞衰老。