石斛属是兰科植物中的第二大属,其中金钗石斛(D.nobile)、铁皮石斛(D.candium)、霍山石斛(D.huoshanness)等是名贵的中草药;石斛属植物中有四分之一可供观赏,以花色艳丽、花期长著称。因此,对春石斛兰进行组织培养、生理生化及遗传转化的研究具有重要的意义。 本试验以春石斛兰(Dendrobium nobile Sw.)为试材,系统地研究了离体培养中各种影响因子对类原球茎和芽的增殖、生长、生根以及长期培养后生长势恢复的影响;研究了在类原球茎分化芽和根系过程中,抗氧化酶系统中多种酶活性及可溶性蛋白的变化规律;同时,对农杆菌介导的春石斛兰转基因进行了初步研究,建立了重复浸染法。主要研究结果如下: (1) 在春石斛兰类原球茎途径的研究过程中,利用春石斛兰的茎节及嫩芽,在添加了0.2mg/LNAA的MS基本培养基上,成功诱导获得了绿色的质地优良的类原球茎;并进一步探索了类原球茎增殖的最佳生长调节剂浓度为BA 0.5mg/L;在对不同有机添加物的对比试验中发现,椰乳和蛋白胨对类原球茎鲜重的增加和增殖效果均较佳,其中以1.0g/L的蛋白胨最佳。 (2) 在芽途径的组织培养研究中,首次在石斛兰上利用腋芽萌发,成功恢复长期离体培养生长势减弱的材料,并通过调控外源氮素水平平衡芽的增殖和生长;优化NAA浓度(0.2mg/L),诱导丛生芽的产生,提高了芽的增殖率;同时发现,影响生长势减弱的春石斛兰生根的关键因素是芽的高度;当然,适宜浓度的蔗糖(20g/L)也是春石斛兰生根所必需的。 (3) 通过对类原球茎和生长势减弱材料芽增殖的研究发现,鲜重增加率/增殖率(F/P值)是衡量类原球茎或芽正常生长与否的一个重要指标。类原球茎的F/P值至0.6时,类原球茎生长健壮,色泽深绿;而F/P值<0.6时,类原球茎生长偏弱,色泽黄绿,部分黄化。而芽增殖的适宜的F/P值在1.14左右。F/P值的提出使春石斛兰生长势的强弱实现量化。 (4) 类原球茎分化过程中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、愈创木酚过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)的活性和可溶性蛋白含量均呈现先降后升的趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活性则呈现先升后降的变化。其中POD是诱导根原基产生的关键酶;可以利用春石斛兰中POD的活性高低,作为鉴定根形态发生与否及生根难易的重要的生理指标。对过氧化物酶同工酶和可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳,进一步证实了类原球茎的分化成苗过程是一个蛋白调控、多种抗氧化酶共同参与的结果。通过对类原球茎分化过程中各种抗氧化酶、同工酶、可溶性蛋白变化规律研究,初步揭示了类原球茎分化过程中的部分规律,为通过生理指标指导组织培养的研究提供了重要的参考。