论文部分内容阅读
真核生物基因表达调控涉及顺式作用元件与反式作用因子、反式作用因子与反式作用因子之间极其复杂的相互作用。核受体超家族属于反式作用因子，是一类配体依赖性转录因子，其成员广泛介导了真核生物与生长、发育和内环境稳定相关基因的表达。目前，核受体调节基因表达的机制正处于广泛的研究中。许多研究表明，核受体在调节靶基因表达时会与一系列有效转录所必需的辅调节蛋白(coregulator)发生相互作用，这类辅调节蛋白主要包括辅活化子(coactivator)和辅阻遏子(corepressor)，核受体通过辅活化子／辅阻遏子与基础转录机器联系在一起，调节不同靶基因的启动子、配体或细胞类型特异性的表达。迄今已分离鉴定出大量的核受体辅活化子，如RIP140、CBP／P300、SRC／p160家族、CARM-1、TRAP／DRIP等，包括最近发现的SRA(一种有辅活化子功能的RNA)。大多数辅活化子结构上均含有与核受体有效相互作用所必须的重复LXXLL模体(NR盒)，它们对核受体转录功能的调节是一个复杂的多步过程，还涉及了核受体结合DNA时对核受体的酶学修饰。 人雌激素受体相关受体1(human estrogen receptor-related receptorl，hERR1)是核受体超家族中的成员，是最早被克隆的孤儿受体之一，与雌激素受体(estrogen receptor，ER)有很高的同源性，广泛表达于体内各种组织，在骨骼发育与形成、脂肪代谢中有重要作用。hERR1的效应元件(hERR1 response element,ERRE)与ERE(ER response element)和SFRE(steroidogenic factor 1 response element)有很高同源性，因而hERR1与ER和SF1的靶基因也有很多交叉和重叠。许多研究发现，hERR1可通过与ER竞争结合DNA，或与ER直接相互作用，影响ER的转录调控功能。hERR1在调节基因表达过程中，还涉及hERR1与TFⅡB及许多辅活化子如ACTR、GRIP1、SRC-1、PNRC等的相互作用。我们的研究发现，hERR1表达于正常及癌变的乳腺组织，并且在癌组织中的表达量明显高于正常乳腺组织，提示hERR1与乳腺癌密切相关。本研究是在上述工作基础上的深入，主要的研究目标和结果如下： 1．采用酵母双杂交技术筛选了人乳腺组织cDNA表达文库中的hERR1的相互作用蛋白质并对结果进行了序列分析和鉴定。 为深入了解hERR1在乳腺癌发生、发展中可能的作用机理，我们采用酵母双杂交第三军医大学博士学位论文结合滤膜影印分析，筛选了人乳腺组织cDNA表达文库，以寻找乳腺组织中能与hERRI发生相互作用的蛋白质;采用酵母双杂交分析结合液相p一半乳糖昔酶活性测定，进一步明确了这种相互作用，并通过测序和序列比对分析，确定了所获得的蛋白质的种类。结果发现:1) hERRI可与多种核受体辅活化子(SRC一1、班P14O、们灯P一l)发生相互作用;2)首次筛选到多个能与hERRI相互作用的蛋白质，其中包括RBP4( retinol bindingpfotein)。 2.检测了RBP4与多种核受体间的相互作用及其对核受体AF一(activation function2)结构域的依赖性。 为进一步明确RBP4与hERRI之间的相互作用，并深入探讨这种相互作用的普遍性，我们采用酵母双杂交技术检测了RBP4与hERRI及其它多种核受体间的相互作用，并分析了这种相互作用对核受体特异性配体及AF一2结构域的依赖性。结果发现:1)在酵母细胞中，RBP4能以配体依赖性或非依赖性方式，与包括hERRI和hER在内的多种核受体发生相互作用:2) RBP4与核受体hER和孤儿核受体mERR3的相互作用，有赖于核受体AF一2结构域的完整性。以上实验结果提示，RBP4可能是一个新的功能有待鉴定的核受体转录激活功能的调节因子。 3.研究了RBP4对hER和hERRI转录激活功能的调节作用。 为了解RBP4的转录调节功能，我们采用瞬时转染结合荧光素酶活性分析的方法，研究了RBP4对hER和hERRI转录激活功能的影响。结果发现:l)在HeLa细胞中，RBP4能以浓度依赖和配体非依赖方式，显著增强hERRI的转录激活功能;2)在HeLa细胞中，RBP4能与hER相互作用，且在一定浓度范围内以浓度依赖和配体依赖方式，显著增强hER的转录激活功能。 4.对RBP4与hERRI相互作用的位点进行了初步鉴定。 综合酵母双杂交及瞬时转染的实验结果，我们初步认为，RBP4是一个核受体辅活化子。为探讨RBP4与hERRI相互作用的分子机理及其在hERRI基因表达调控中的作用，我们采用缺失突变和酵母双杂交分析等方法，初步探讨了RBP4与hERRI的相互作用位点。结果发现:1) RBP4的aa19一108是其与hERR.1发生相互作用的主要部位;2)RBP4的aa1Og一199不是RBP4与hERRI相互作用的主要部位，但位于该部分的一些氨基酸残基可能参与了这二者之间的相互作用;3) RBP4的aa133一199未见能与hERRI发生相互作用，而位于RBP4N一末端的信号肤序列(aal一18)，可能干扰RBP4与hERRI的相互作用。 以上研究结果表明:1) hERRI转录调节功能的发挥，有赖于多种蛋白因子包括核受体辅活化子及其它一些功能有待进一步明确的蛋白质的参与;2) RBP4是被筛选到的hERRI相互作用蛋白之一，可能参与了对hERRI转录激活功能的调节过程;3)RBP4第三军医大学博士学位论文能以配体依赖性、AF一2依赖性方式，与被检测的绝大多数核受体?