论文部分内容阅读
对本实验室保藏的高天冬氨酸转氨酶活力的重组大肠杆菌E. coli SW0209-52进行了细胞固定化方法、条件、固定化细胞填充床反应器连续转化，转化液中的L-苯丙氨酸提取的研究并且进行了整个过程原材料成本的初步估算。确定了卡拉胶包埋与0.05%的戊二醛后处理结合的固定化方法，卡拉胶浓度2.5%，菌体量7.5%，得到的固定化细胞酶活回收率为73%。考察了固定化细胞转化过程中各个因素的影响，确定了最适的转化条件pH为8.0、温度为37℃，确定了最适磷酸吡哆醛（PLP）浓度为100μmol/L。细胞经固定化后操作稳定性与贮存稳定性较游离菌显著提高。比较了PLP与维生素B6作为天冬氨酸转氨酶辅酶的效果，由于维生素B6在ATP的作用下可以转化成为磷酸吡哆醛，所以维生素B6在一定程度上可以替代PLP，但是以维生素B6作为辅酶时固定化细胞的稳定性与PLP为辅酶时固定化细胞的稳定性相比较差。通过考察高径比对连续反应的影响，选择高径比为13.3的填充柱组成固定化细胞填充床反应器进行L-苯丙氨酸连续转化的研究。分别考察了底物浓度和停留时间对连续转化的影响，综合考虑底物转化率和体积产率，确定了流加底物（苯丙酮酸）浓度30 g/L，停留时间10 h作为考察填充床反应器稳定性的条件。在此条件下，填充床反应器连续运转40天，苯并酮酸的转化率均在85%以上，L-苯丙氨酸平均体积产率为1.85g/L/h，显示了固定化细胞填充床反应器较好的操作稳定性。比较了19种树脂对L-苯丙氨酸的吸附情况和对L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸的选择性，确定了以均孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂JK006来分离转化液中的L-苯丙氨酸，考察了不同吸附，洗脱，脱色条件对L-苯丙氨酸提取的影响，确定了最适操作条件：转化液pH 2.0，L-苯丙氨酸浓度5 g/L，吸附温度20℃，1 mol/L的氨水以1 mL/min的流速洗脱，D4006树脂脱色。脱色后的转化液经过浓缩、结晶、乙醇洗涤、重结晶，得到纯度为96.7%的L-苯丙氨酸晶体，整个提取过程收率为82.8%。初步估算了利用固定化细胞连续转化制备L-苯丙氨酸的整个过程所需的原料成本，并对分别利用5’-磷酸吡哆醛和维生素B6作为转氨酶辅酶的连续转化和分批转化过程成本进行了比较。由于维生素B6价格低廉，在利用维生素B6的分批转化过程中，虽然固定化细胞成本上升，但其总转化成本仍有一定程度的下降。为了进一步降低生产成本，实现固定化细胞制备L-苯丙氨酸的工业化，还需要对磷酸吡哆醛辅酶的固定化及通过过程优化、补充ATP等方法提高维生素B6代替磷酸吡哆醛时固定化细胞的操作稳定性进行更深入的研究。