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研究背景脑胶质母细胞瘤是常见的中枢神经系统原发性肿瘤,其恶性程度高、发病率高,病人预后差。化疗作为治疗恶性肿瘤的一个重要手段,然而药物使用一段时间后,绝大多数的肿瘤细胞都会产生耐药性,从而导致化疗的失败。根据美国癌症学会统计,在死亡的病人当中有90%以上的人存在耐药性,由FDA批准的治疗胶质母细胞瘤化疗药物中替莫唑胺由于其全身毒副作用小,可以很好的透过血脑屏障,被广泛用临床一线当中。但肿瘤细胞也不可避免的对其产生了耐药性,所以筛选和研发增敏替莫唑胺杀伤作用的药物是很有必要的。阿维菌素(avermectins,AVMs)是由阿维链霉菌产生的一类大环内酯类抗生素。AVMs通常是用来治疗寄生虫感染等疾病,主要是通过触杀和胃毒作用来发挥对害虫的毒杀效果。研究发现AVMs可以抑制P-糖蛋白对其底物的外排作用,从而降低肿瘤细胞的多药耐药性。本课题组在前期预实验中也发现AVMs对胶质瘤U87细胞、胶质瘤U251细胞的增殖均有明显抑制作用,且可以诱导细胞凋亡,但其作用机制尚未明确。本文就以胶质瘤U87、U251和T98细胞为研究对象,探讨AVMs抗肿瘤的作用机制,为阿维菌素抗肿瘤新药研发及其临床应用提供坚实的理论基础。第一部分阿维菌素对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制研究研究目的研究阿维菌素对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制。研究方法1.分别用不同浓度的 AVMs(0、2μM、4μM、6μM、8μM、1OμM、12μM)处理胶质瘤两种细胞系(U87和U251)不同时间(24、48、72小时),采用MTT法检测AVMs对细胞增殖的影响;2.不同浓度的AVMs(0、4μM、8μM)处理细胞72小时后,用Annexin V-FITC/PI染色胶质瘤细胞,在流式细胞仪下检测细胞凋亡的情况;3.不同浓度的AVMs(0、4μM、8μM)处理细胞72小时采用JC-1法染色各组细胞,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位;4.不同浓度的AVMs(0、4μM、8μM)处理细胞72小时后,提取总RNA反转录并采用Real-time PCR检测bcl-2、bax、caspase3 mRNA表达水平;5.不同浓度的AVMs(0、4μM、8μM)处理细胞72小时后,提取总蛋白,用 Western blotting 检测 bcl-2、bax、caspase3 蛋白表达水平。研究结果1.AVMs对胶质瘤U87和U251细胞增殖有抑制作用,并呈现剂量和时间依赖性;2.AVMs可以诱导胶质瘤U87和U251细胞的凋亡,实验组相对于对照组凋亡率均增加了(P<0.05);3.AVMs可以U87和U251细胞的线粒体跨膜膜电位,实验组相对于对照组红/绿荧光强度比均增加了(P<0.05);4.PCR和Western bloting结果提示:AVMs可以促进U87和U251细胞中caspase3、bax mRNA和蛋白分子的表达水平(P<0.01),同时降低bc12 mRNA和蛋白分子的表达水平(P<0.01)。研究结论1.AVMs具有抑制胶质瘤U87和U251细胞增殖的作用;2.AVMs可以促进胶质瘤U87和U251细胞的凋亡,其作用机制可能是与触发线粒体凋亡途径有关。第二部分阿维菌素对替莫唑胺杀伤胶质瘤细胞的影响及相关机制研究研究目的研究阿维菌素对替莫唑胺杀伤胶质瘤细胞的影响及其相关机制。研究方法1.分别用MTT法检测AVMs、TMZ以及AVMs+TMZ对胶质母细胞瘤三种细胞系(U87、U251和T98)增殖的影响,测出它们的IC50;2.采用Chou-Talalay法评估AVMs与TMZ的联合效应;3.不同浓度的AVMs(0、4μM、8μM)处理细胞72小时后,采用RT-PCR检测ABCB1、ABCG2以及MGMTmRNA分子表达水平;4.不同浓度的AVMs(0、4μM、8μM)处理细胞72小时后,采用Western blotting检测ABC转运蛋白(ABCB1、ABCC1、ABCG2)以及MGMT蛋白分子表达水平。研究结果1.AVMs、TMZ以及AVMs+TMZ对胶质瘤细胞增殖均有抑制作用,并呈现剂量和时间依赖性;2.AVMs+TMZ在IC50的时候对U87、U251以及T98细胞的CI(联合指数)分别为:0.85、0.72、0.34;3.RT-PCR和Westernbloting结果提示:AVMs可以促进U87和T98细胞中ABCB1、ABCG2mRNA和蛋白分子的表达水平(P<0.05),同时也降低T98细胞中MGMTmRNA和蛋白分子的表达水平(P<0.05)。研究结论AVMs与TMZ具有协同作用,其可能的作用机制是通过降低ABCB1、ABCC1、ABCG2以及MGMT蛋白分子表达水平来增加TMZ对肿瘤细胞的杀伤作用。