论文部分内容阅读
研究目的1.研究双脱甲氧基姜黄素作用卵巢癌细胞株SKOV3后生长情况。2.探讨双脱甲氧基姜黄素作用卵巢癌细胞株SKOV3后STAT3蛋白及基质金属蛋白酶和与肿瘤侵袭转移相关蛋白表达的变化。3.研究双脱甲氧基姜黄素对卵巢癌细胞株SKOV3粘附、侵袭和转移的作用及其机制。4.寻找和发现与肿瘤转移相关的因素来理解卵巢癌的发生和发展及转移侵袭中发生的分子生物学改变,从而找到抑制肿瘤转移的新方向。研究方法1.体外培养卵巢癌细胞株SKOV3细胞。2.采用MTT方法检测未用药物组及观察不同浓度药物处理组(5μM、10μM、15μM)双脱甲氧基姜黄素作用卵巢癌细胞株SKOV3细胞6、12、24小时后的吸光值,并计算双脱甲氧基姜黄素对SKOV3细胞抑制率值。3.应用流式细胞术检测不同浓度和时间双脱甲氧基姜黄素(5μM、10μM、15μM)作用卵巢癌细胞株SKOV3后细胞周期的改变,并与对照组比较。4.应用倒置显微镜观察不同浓度双脱甲氧基姜黄素(5μM、10μM、15μM)作用于卵巢癌细胞株SKOV3并观察24h后卵巢癌细胞形态改变。5.采用细胞划痕实验方法观察对照组和不同浓度双脱甲氧基姜黄素(BDMC)处理后对卵巢癌细胞SKOV3迁移能力的影响。6.采用transwell小室方法观察不同浓度双脱甲氧基姜黄素(BDMC)处理后对卵巢癌细胞SKOV3侵袭转移能力的影响。7.采用粘附实验方法检测不同浓度双脱甲氧基姜黄素(BDMC)抑制卵巢癌细胞株SKOV3粘附能力的影响。8.利用Western blot方法检测不同浓度双脱甲氧基姜黄素(5μM、10μM、15μM)作用卵巢癌SKOV3细胞株24h后STAT3/p-STAT3,粘附分子(VCAM-1/ICAM-1),基质金属蛋白酶(MMP2/9, TIMP-1) uPA, CD147蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。9.应用细胞免疫荧光化学方法检测不同浓度双脱甲氧基姜黄素(5μM、10μM、15μM)作用卵巢癌SKOV3细胞24小时后癌细胞中CD147,uPA蛋白的表达,以及细胞核的变化。10.应用Real-TimePCR技术检测不同浓度双脱甲氧基姜黄素(BDMC) (5μM、10μM、15μM)对卵巢癌SKOV3细胞中STAT3mRNA和其下游基因MMP-2mRNA及DDK-1mRNA的表达。研究结果1.双脱甲氧基姜黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3生长具有抑制作用,其抗增殖效应并呈剂量时间依赖性。2.流式细胞仪方法分析证实双脱甲氧基姜黄素能使SKOV3细胞周期阻滞于G1期,影响DNA合成,并随着药物不同浓度和时间,呈现剂量-时间依赖方式。3.倒置显微镜观察显示:随着双脱甲氧基姜黄素浓度的增高,卵巢癌细胞株SKOV3形态逐渐发生变化,癌细胞数量明显减少,胞质浓缩,部分细胞体积明显缩小,细胞轮廓不规则,生长缓慢。随着药物浓度的增大和作用时间的延长,癌细胞数量减少更明显,凋亡细胞增多。4.细胞划痕实验结果:药物组和对照组划痕后在显微镜下视野中可见一条细长宽的无细胞划痕区。含10%血清1640培养液培养24h后对照组细胞运动迁移基本上覆盖了大部分划痕区,而实验组随着双脱甲氧基姜黄素的浓度增大,卵巢癌SKOV3细胞向划痕区移动的距离越来越小,划痕区宽度依然明显存在。5.卵巢癌SKOV3细胞侵袭实验用transwell小室测定结果:不同浓度的双脱甲氧基姜黄素对卵巢癌SKOV3细胞侵袭和迁移具有抑制作用,药物处理组的SKOV3细胞浸润穿过Matrigel膜的细胞数要比对照组的细胞数明显减少,呈剂量依赖性。6.粘附实验结果:在倒置显微镜下,SKOV3细胞对Fn及Matrigel胶有较强的粘附性,癌细胞贴壁伸展的数量逐渐增多。在相同时间点,不同浓度的双脱甲氧基姜黄素对卵巢癌SKOV3细胞的粘附力有一定的抑制作用,且剂量越高,抑制纤维连接蛋白Fn及Matrigel胶的促癌细胞粘附作用增强。7. Western blot结果:显示不同浓度的双脱甲氧基姜黄素与对照组相比,STAT3/p-STAT3,粘附分子(VCAM-1/ICAM-1),基质金属蛋白酶(MMP-2/9),uPA及CD147蛋白水平的表达明显下降,且呈剂量依赖性,而各浓度药物组TIMP - 1蛋白表达水平与对照组相比,明显增强,随着药物浓度的增加,TIMP - 1蛋白表达水平逐渐升高。8.细胞免疫荧光结果:显示随着双脱甲氧基姜黄素浓度的增高,卵巢癌SKOV3细胞内CD147及uPA表达逐渐减少,细胞内细胞核染色明显减弱,甚至出现细胞核碎裂,凋亡小体,且具有剂量依赖性。9. Real-Time PCR结果显示:不同浓度双脱甲氧基姜黄素作用后卵巢癌细胞SKOV3,随着药物浓度增高,STAT3mRNA及下游基因MMP-9mRNA,DKK-1mRNA表达逐渐减弱,具有一定的统计学意义。研究结论双脱甲氧基姜黄素对卵巢癌SKOV3细胞有明显的抑制增殖、粘附、侵袭和迁移作用,并能诱导SKOV3细胞G1期阻滞,通过抑制细胞生长周期,降低细胞增生速率从而抑制肿瘤细胞增殖;另外还可以通过降低基质金属蛋白酶及其下游因子的表达降低肿瘤细胞的侵袭和转移,此作用可以通过抑制STAT3信号通路来抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭和转移。总之STAT3信号通路给卵巢癌的治疗提供一个新的广阔前景,这也是双脱甲氧基姜黄素抑制卵巢癌SKOV3细胞侵袭和转移分子机制之一。