论文部分内容阅读
目的：研究常山酮对放疗所致肿瘤细胞上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的抑制作用,并探讨其可能机制。方法：采用MTT法观察常山酮乳酸盐对LLC细胞的毒性,确定合适给药剂量。选用LLC细胞为研究对象,观察常山酮对电离辐射所致的肿瘤细胞EMT的抑制作用。将LLC细胞分为4组,对照组不做任何处理；单纯常山酮组予含恒定浓度常山酮乳酸盐的全培养基培养并持续给药至下一步实验开始；单纯照射组予单次10Gy剂量的6-MV X线照射；联合组先予常山酮全培养基培养细胞,1天后予单次10Gy剂量的6-MV X线照射,细胞培养期间保持培养基内常山酮浓度恒定。采用免疫印迹法分别检测照射后2天及5天时4组细胞的P-Smad3判断TGF-β信号传导通路激活情况,确定进一步实验的时间点。通过显微镜观察、划痕实验及Transwell侵袭实验检测4组细胞形态学、迁移及侵袭能力的变化。利用免疫印迹法检测电离辐射及常山酮对LLC细胞EMT标志物.TGF-β信号传导通路下游相关蛋白(P-Smad2、P-Smad3和Smad7)的变化。结果：通过24、48h的MTT实验绘制常山酮乳酸盐对LLC细胞的抑制曲线并计算出48h时常山酮乳酸盐对LLC细胞抑制20%时的浓度为31.17ng/ml。单纯照射组LLC细胞表达的P-Smad3蛋白水平在照射后5天时较照射后2天时明显升高,故进一步实验的时间点选择为照射后5天时。照射后5天时与空白对照组比较,单纯常山酮组划痕伤口愈合面积减少,Transwell小室穿膜细胞数明显减少,同时上皮标志物E-Cadherin表达升高,间质标志物N-Cadherin表达降低；与空白对照组比较,单纯照射组细胞极性消失,并向纺锤样间质细胞形态演变,划痕伤口愈合面积明显增多,Transwell小室穿膜细胞数增多,同时上皮标志物E-Cadherin表达降低,间质标志物N-Cadherin表达升高；联合组较单纯照射组间质细胞形态被逆转,划痕伤口愈合面积减少,Transwell小室穿膜细胞数亦明显减少,同时上皮标志物E-Cadherin表达升高,间质标志物N-Cadherin表达降低。TGF-β1信号传导通路相关因子检测发现,单纯常山酮处理后的LLC细胞Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平较空白对照组明显下降,Smad7蛋白表达较空白对照组明显升高；10Gy单次照射后LLC细胞的Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平较空白对照组明显升高,Smad7蛋白表达较空白对照组明显降低；而联合组LLC细胞的Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平较单纯照射组明显下降,Smad7蛋白表达较空白对照组明显升高。结论：常山酮可以抑制电离辐射所致的肿瘤细胞EMT,其可能作用机制是通过抑制肿瘤细胞内TGF-β信号传导通路来实现的。