背景和目的哮喘是一个严重的慢性炎症疾病,在全球范围内约有3亿人群有严重的哮喘,给国家、家庭、个人造成严重的经济负担。美国每年因哮喘死亡约200-3000例,且有增加趋势。支气管哮喘是由各种炎症细胞、结构细胞及细胞组分参与的气道慢性过敏反应性炎症性疾病,长期慢性气道炎症导致气道高反应性、可逆性气流阻塞及气道重塑。气道慢性炎症持续存在并构成哮喘发病的核心因素,主要表现为：①支气管粘膜上皮组织中大量的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润；②支气管内膜纤毛细胞受损或坏死、上皮坏死脱落。粘膜水肿和充血,粘膜上皮层杯状细胞增多,粘液腺增生、大量分泌物和粘液存留；③器官平滑肌增生肥厚、支气管壁增厚和基底膜增厚。近期的研究让我们认识到哮喘不仅仅是单纯的气道炎症,还涉及到气道结构重塑。支气管哮喘导致气道结构重塑是以气道上皮损伤,管壁增厚和皮下纤维化为特点。气道重构是引起慢性哮喘患者气道不可逆或部分不可逆阻塞的病理基础,是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主要因素。支气管哮喘多发于市中心的居住人群中,最主要的原因可能是由于长期暴露于过敏原中,尤其早期暴露于蟑螂过敏原中可以导致过敏性气道炎症和哮喘的发病率增加。一项国际合作市区哮喘研究(NCICAS)发现有60-80%的儿童被蟑螂过敏原致敏,提示蟑螂过敏原是市区中支气管哮喘发生的重要因素[7]。然而关于蟑螂过敏原诱导的哮喘的机制尚未完全阐明。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是属于中胚层的具有强大自我更新和多项分化潜能的一类多能干细胞[8,9],可在一定条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪组织、肝脏细胞、神经细胞、心肌细胞等中胚层及中胚层来源以外的细胞[10,11]间充质干细胞MSCs主要来源于骨髓,还广泛分布于肌肉、滑膜、肺脏、肝脏、脐带血、外周血以及脂肪组织中。此外间充质干细胞具有免疫原性低,表面表达各种黏附分子和趋化因子,故容易迁移并存留于不同的组织中。研究表明,间充质干细胞MSCs具有很强的免疫抑制能力,起作用对象几乎涉及所有的免疫细胞,包括NK细胞、T细胞和B淋巴细胞及DC等[12-14]。因此从理论上讲,间充质干细胞MSCs可减轻肺炎症反应,并有免疫调节功能,对哮喘应有治疗作用。对哮喘的治疗作用可能是通过间充质干细胞MSCs对哮喘气道炎症及气道重塑的作用和间充质干细胞MSCs对哮喘炎症因子分泌的影响。但目前间充质干细胞MSCs治疗哮喘的机制尚不明确。转化生长因子TGFβ1是个多功能的细胞因子,它在细胞生长,分化、免疫调节、炎症和损伤修复等方面发挥重要的作用[15-17]。乳动物体内至少发现有转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β33个亚型,其中以转化生长因子β1在人体细胞所占比例最高,并可由多种细胞合成和分泌[18,19]。转化生长因子TGFβ1最初以潜活性复合物形式存在于细胞外基质中,当机体受到机械应力、创面修复、组织损伤和炎症时,转化生长因子TGFβ1在体内纤溶酶或其他蛋白酶作用下,使潜活性复合物中的潜活性相关肽(latency associated peptide, LAP)与TGFβ二聚体分开,释放活性TGFβ发挥生物学效[20,21]。活化的TGFβ的二聚体先与两个Ⅱ型受体的二聚体结合,此复合物接着再募集两个Ⅰ型受体。活化的Ⅰ型受体可以磷酸化其下游信号分子-受体活化Smad2和Smad3。被磷酸化的Smad2和Smad3接着与Smad4形成三聚体复合物,这一复合物可进入细胞核,在DNA结合辅助因子的帮助下与DNA上被Smad结合元件的区域结合后诱导转录。近期研究发现TGFβ1也在气道修复重塑中起重要,而且发现在哮喘病人及过敏原诱导的哮喘小鼠的气道中发现活化的TGFβ1明显增加[7,22]。因此,本研究的主要目的是：1.蟑螂过敏原建立哮喘小鼠模型并观察肺内间充质干细胞的募集和TGFβ1的活化；2.骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定；3.TGFβ1对间充质干细胞在蟑螂过敏原诱导下的募集与迁移的影响；4.间充质干细胞在蟑螂过敏原诱导的过敏性炎症中的作用及机制以及TGFβ1在这个过程中的作用。材料和方法1.在本研究中以6-8周体重相匹配的雌性C57BL/6J、Nes-GFP、鼠为研究对象。小鼠通过蟑螂过敏原致敏和激发建立哮喘模型。所有的小鼠严格依照霍普金斯大学医学院对动物的要求,所有小鼠均需在无特异性病原体的环境下生长。动物实验项目已获得了霍普金斯大学医学院的各项许可(动物项目：M013M308)。2. 通过酶联免疫吸附试验ELISA检测肺泡灌洗液、血清中以及条件培养基中活化型TGFβ1表达水平及IL-4、IL-13、INFy和IL-17A等细胞因子在肺泡灌洗液中的表达。3.通过流式细胞学分析肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及粒细胞各自占细胞总数的百分比；鉴定从骨髓中分离培养的间充质干细胞；检测肺门淋巴结中调节T细胞所占的百分比。4.肺组织H&E染色观察肺组织炎症；免疫组织化学染色观察间充质干细胞在肺组织募集及p-Smad2/3在肺组织的表达；免疫荧光染色观察p-Smad2／3在蟑螂过敏原刺激后的间充质干细胞中的表达；追踪间充质干细胞MSCs在体内募集和迁移；5.通过全骨髓贴壁培养法培养骨髓间充质干细胞,并对第三代细胞进行茜素红Alizarin Red、油红O和甲苯胺蓝染色,鉴定间充质干细胞在是否分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。6. Western blot检测p-Smad2/3和Smad2/3在蟑螂过敏原刺激后的间充质干细胞中的蛋白表达水平。7.通过Real- time PCR检测M1型和M2型巨噬细胞的细胞因子和表面分子的表达。8.通过体外细胞迁移实验观察间充质干细胞在体外迁移。9.统计学处理：所有数据均以均数±标准误(mean±S E)表示,应用IBM SPSS Statistics22软件进行统计学处理。样本均数采用单样本t检验(one-sample t test)和独立样本t检验(Independent-sample t test)。满足方差齐性要求时,多组样本均数采用方差分析(One-Way ANOVA).多重比较采用bonferroni法；不满足方差齐性要求时,多组样本采用Welch法,多重比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05表示有统计学差异。结果1.蟑螂过敏原明显增加气道炎症建立蟑螂过敏原提取物CRE诱导的哮喘模型。与PBS对照组相比,实验组经过CRE致敏和激发后明显增加炎症细胞总数,其中嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,肥大细胞和淋巴细胞也显著增加。而且组织学染色也发现与对照组相比,CRE诱导的小鼠模型肺中招募了较多的炎症细胞,同时也增加了血清中蟑螂过敏原特异性IgE。2间充质干细胞MSCs在蟑螂过敏原刺激的小鼠肺组织中募集增加为了研究是否经过CRE致敏和刺激后间充质干细胞MSCs能迁移到气道中。已有体外研究报道巢蛋白nestin可以作为骨髓源性间充质干细胞BMSCs的标记物。组织切片分析显示与对照组PBS刺激相比,经CRE刺激后小鼠肺组织上皮和皮下细胞中有较多数量的nestin+细胞。3 TGF β1信号通路在CRE刺激的小鼠肺组织中和CRE刺激的间充质干细胞中被激活我们最近的研究已经证明从损伤血管中激活的TGFβ1能够调节间充质干细胞MSCs的动员和募集来参与组织的修复和重塑[23]。为了研究是否TGFβ1信号通路参与间充质干细胞MSCs在哮喘肺组织的迁移,我们检测CRE诱导的小鼠的肺泡灌洗液(BALF)和血液中活化的TGFβ1的表达水平,结果发现与对照PBS组小鼠相比,CRE刺激的小鼠肺泡灌洗液和外周血中活化的TGFβ1表达水平显著增加,组织学染色发现有较多的磷酸化Smad2/3+的气道上皮及上皮下的炎症细胞。同样发现间充质干细胞MSCs经过蟑螂过敏原刺激后能分泌较多激活的TGFβ1。Western Blot显示与对照组相比,经过CRE刺激后间充质干细胞MSCs上 p-Smad2/3表达增加。免疫荧光进一步发现蟑螂过敏原CRE能增加间充质干细胞MSCs激活的TGFβ1信号。4 骨髓间充质干细胞BMSCs的形态间充质干细胞为贴壁生长细胞,且可以聚集成均匀的细胞集落,形成纤维样的细胞克隆。原代间充质干细胞培养时,细胞接种3-4小时后开始贴壁,24小时大量贴壁；2-3天形成部分集落,7-10天开始迅速扩增,显微镜下观察到以梭形细胞为主,胞浆丰富,核大,细胞平行或呈涡旋状盘旋排列；14天左右细胞融合达80%-90%,可传代培养。5骨髓间充质干细胞BMSCs的鉴定及分化由于间充质干细胞MSCs缺乏特异性的表面标志物,因而骨髓细胞体外培养较难获得纯的间充质干细胞。间充质干细胞MSCs通过荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting,FACS)Sca-1,CD29,CD45和CD11b四种抗体分离,表达出Sca-1+ CD29+ CD11b-CD45-的细胞即为间充质干细胞。间充质干细胞MSCs在不同的条件培养基诱导下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。通过检测α-SMC(abcam)表达来评价间充质干细胞MSCs分化为平滑肌样细胞,间充质干细胞MSCs经过TGFβ1(2.5ng/m1)诱导72小时后,免疫荧光染色,DAPI染核后发现表达较多α-smooth muscle actin(α-SMA)。6 转化生长因子TGF β 1介导由人上皮细胞条件培养基诱导的间充质干细胞的迁移为了检测在外界环境过敏原的刺激下上皮细胞释放的活化的TGFβ1能够诱导间充质干细胞MSCs迁移,我们进行了细胞迁移实验。与未经CRE刺激的人上皮细胞条件培养基相比,经CRE刺激的人气道上皮条件培养基组里面迁移了较多的间充质干细胞MSCs,而且TGFβ1的表达水平也增加。为了进一步检测是否TGFβ1在间充质干细胞MSCs的迁移中起重要作用,我们首先检测了人上皮细胞条件培养基中激活的TGFp1的表达水平。与DMEM和未经CRE刺激的人上皮细胞条件培养基相比,经过CRE刺激的人上皮细胞条件培养基表达了较多的激活的TGFβ1。进一步为了检测在人上皮细胞条件培养基中活化的TGFβ1在间充质干细胞MSCs的迁移中起重要作用,在人上皮细胞条件培养基中加入TGFβ1中和抗体后间充质干细胞迁移数量显著减少。然而在人上皮细胞条件培养基中加入对照抗体IgG或加入能诱导多种类型细胞迁移的趋化因子SDF-1a/CXCL12抗体后对间充质干细胞MSCs的迁移没有影响。进一步当在人上皮细胞条件培养基中加入不同浓度的TGFβ受体TβRI激酶抑制剂SB50512(0.5,1.0,和2.0μM)后,间充质干细胞的迁移显著被抑制(以浓度依赖性方式)。为了进一步确认TGFβ1在间充质干细胞MSCs迁移中的直接作用,在DMEM中加入不同浓度的重组的TGFβ1(5,10 和 20ng/ml)后加入到迁移系统小室下层,发现DMEM中加入重组TGFβ1后有较多的间充质干细胞MSCs发生迁移,且以浓度依赖的方式。7 TGFβ1介导内源性间充质干细胞向肺组织募集和迁移为了在体内追踪内源性间充质干细胞的募集和迁移,我们用Nes-GFP转基因小鼠,分为3组：PBS组、CRE组和CRE+TGFβAb组建立蟑螂过敏原诱导的哮喘模型。Nes-GFP小鼠经过CRE刺激后GFP+MSCs在气道和肺泡灌洗液中显著增加。给Nes-GFP小鼠注入TGFβ1中和抗体后,增加的GFP+MSCs显著减少。为了研究是否有间充质干细胞从外周血募集到肺组织,我们在原来建立的哮喘模型基础上,在刺激的第一天(D10)通过小鼠尾部右侧静脉注射GFP+MSCs(1x106)。与CRE+PBS组相比,CRE+MSCs肺组织中募集了较多的GFP+细胞。然而与CRE+MSCs相比,CRE+MSCs+TGFβ1Ab组抑制了GFP+细胞在肺组织的募集。8间充质干细胞MSCs抑制了蟑螂过敏原诱导的过敏性炎症在小鼠体内注入GFP+MSCs后,我们也观察了MSCs对于过敏性炎症的影响。研究结果发现与CRE+PBS组相比,CRE+MSCs组肺泡灌洗液中总细胞数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞明显减少,同时肺组织H&E染色提示气管周围炎症细胞浸润显著减少。进一步验证TGFβ1在间充质干细胞MSCs抑制炎症和气道修复中的作用,结果显示与CRE+MSCs组相比,CRE+MSCs+　TGFpl组肺泡灌洗液中细胞总数显著增加,其中嗜酸性粒细胞增加较为明显,肺组织气管周围炎症细胞浸润显著增加。同时我们也进一步检测了肺泡灌洗液中各种细胞因子的表达。结果我们发现与CRE+PBS组相比,CRE+MSCs组Th2细胞因子IL-4,IL-13及IL-17A的表达显著减少,而Thl细胞因子IFNγ表达稍增加。9间充质干细胞MSCs可通过增加调节T细胞抑制炎症我们通过流式细胞分析检测了肺门淋巴结中CD4+CD25+FoxP3+　Treg的百分比。结果发现与CRE+PBS相比,CRE+MSCs组增加了调节T细胞的百分比。而与CRE+MSCs组相比,CRE+MSCs+　TGFβ1组调节T细胞的比例没有显著的差别。10间充质干细胞能够诱导巨噬细胞的极化M2型巨噬细胞具有抗炎和组织修复的功能,为了进一步阐明间充质干细胞MSCs抑制蟑螂过敏原诱导的过敏性炎症,我们假设间充质干细胞MSCs能够调节巨噬细胞的极化。为了验证这一假说,我们从各组小鼠肺组织中分离培养出巨噬细胞,RT-PCR结果显示与CRE+PBS相比,CRE+MSCs组M2型细胞表面分子Arg-1、FIZZ1和YM-1表达增加,M1型巨噬细胞细胞因子IL-1β、IL-6和NOS2表达减少。与CRE+MSCs 组相比,CRE+MSCs+　TGF β1组M2型细胞表面分子Arg-1表达降低,FIZZ1和YM-1表达有显著降低趋势；M1型巨噬细胞细胞因子IL-1β、IL-6和NOS2表达有显著增加。结论1.蟑螂过敏原致敏和激发后成功建立哮喘小鼠模型。2.间充质干细胞在CRE诱导的哮喘小鼠肺组织中募集,且TGFβ1被激活。3.从小鼠骨髓中成功分离出骨髓间充质干细胞,并成功诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。4.间充质干细胞在CRE刺激下在体外可以发生迁移,在体内间充质干细胞可以从骨髓和血液中向肺组织募集和迁移,TGFβ1在体内和体外可以调节间充质干细胞的迁移。5.间充质干细胞能改善CRE诱导的过敏性炎症。减少Th2细胞因子表达,上调了调节T细胞的百分比及诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,且TGFβ1参与间充质干细胞抑制炎症的过程。综上所述,间充质干细胞在CRE致敏和激发后能够从骨髓或者外周血中向气道损伤或炎症部位募集和迁移,可以通过降低Th2细胞因子表达、上调肺门淋巴结中调节T细胞的比例、诱导巨噬细胞向M2型极化等途径来改善蟑螂过敏原诱导的过敏性炎症。经蟑螂CRE刺激后产生的TGFβ1是能够调控间充质干细胞MSCs迁移的一个主要的促迁移因子,且参与间充质干细胞抑制炎症的过程。此研究为临床上用间充质干细胞治疗哮喘提供了有力的证据。