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胚胎对于母体来说是半同种异体移植物，母体免疫系统能否识别并耐受胚胎抗原，将直接影响妊娠的结局。这说明母胎间存在着免疫耐受，它受母胎界面局部免疫和孕妇系统免疫的共同调控，特别是母胎界面局部免疫，一旦这种母胎免疫耐受机制紊乱，URSA及其他病理妊娠就有可能发生。CD4+CD25+Treg细胞作为有免疫抑制功能的细胞群体，在维持妊娠期母胎免疫耐受平衡中扮演着重要角色，Treg细胞数量和功能的异常会引起母胎免疫耐受的失衡。但以CD4+CD25higb或CD4+CD25+Foxp3+亚型作为其分子标志，并不能真实反应体内Treg细胞的水平。IL-7R(CD127)是T淋巴细胞膜表面受体，在Treg细胞中低表达或不表达，与Foxp3表达呈正相关，低表达CD127的Treg细胞同样具有抑制自身效应T细胞的能力，是新的更为理想的Treg细胞表面分子标志。以此为标记的Treg细胞的数量和功能变化对URSA患者蜕膜局部免疫耐受环境的影响，目前尚无相关研究。
蜕膜NK细胞在母体免疫系统对胎儿同种抗原的识别中也有至关重要的作用。作为维持母胎免疫耐受的两类主要免疫细胞，Treg细胞和NK细胞的数量和功能的平衡有利于正常妊娠的继续。随着对Treg细胞功能研究的深入，其对NK细胞功能的调控也渐受关注，在URSA中Treg细胞是否能够引起NK细胞功能变化，目前尚无文献报道。本课题主要以CD4+CD25+CD127dim/-为Treg细胞的表面标记，从URSA患者蜕膜Treg细胞和NK细胞的表达频率和功能变化为契入点，期望通过实验研究，能够揭示URSA母胎界面Treg细胞对NK细胞的功能调控机制，阐明它们在免疫耐受失衡导致流产中的作用机理。
1.蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的分离和体外扩增
探讨CD4+CD25+CD127dim/-作为蜕膜Treg细胞分子标志的有效性及优势。以CD4+CD25+CD127dim/-三抗原标记法作为识别蜕膜Treg细胞的分子标志，用MACS分离纯化CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞，在体外用anti-CD3+anti-CD28+IL-2进行扩增培养，采用实时荧光定量RT-PCR和FCM分析CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞胞内Foxp3表达，用FCM检测CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞在正常早孕人流妇女蜕膜淋巴细胞中的表达频率。结果显示：从蜕膜中分离出的CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞可在体外扩增，2周内细胞数量可扩增50倍，扩增后的CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞表型稳定，纯度可达91.11％；扩增后的CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞胞内高表达Foxp3；正常早孕人流妇女蜕膜淋巴细胞中CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞表达频率为2.97％±1.19％，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达频率为2.02％±0.83％，CD4+CD25highTreg细胞表达频率仅为1.60％±0.80％； CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞表达频率显著高于CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CD25highTreg细胞表达频率，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达频率显著高于CD4+CD25highTreg细胞表达频率。CD4+CD25+CD127dim/-是新鲜分离和体外扩增培养Treg细胞的有效标志，以此为标志能更加准确全面地反映体内Treg细胞水平，并便于分选获得大量Treg细胞，为Treg细胞的功能研究奠定基础。
2.URSA蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的表达频率和功能研究
比较CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞在正常早孕妇女与URSA患者蜕膜中的表达频率和功能变化，揭示CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞对URSA患者蜕膜局部免疫耐受环境的影响。留取URSA组(URSA患者21例)和对照组(正常早孕人流妇女30例)蜕膜组织，并制备成DMC，采用FCM分析两组蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的表达频率及CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞胞内Foxp3，IL-10和TGF-β表达水平；体外增殖试验检测CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞对自身效应T细胞的增殖抑制功能；通过体外培养抗体封闭，观察IL-10和TGF-β在介导CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞免疫抑制功能中的作用。结果显示：URSA中蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞表达频率显著降低，CD4+CD25+Foxp3+细胞表达频率也显著降低，但CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞表达频率要明显高于CD4+CD25+Foxp3+细胞表达频率；URSA蜕膜中CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞对自体效应性T细胞的增殖抑制作用显著下降，CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞内Foxp3，IL-10和TGF-β表达频率均明显降低；抗IL-10和TGF-β抗体可部分阻断蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的免疫抑制功能。蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞表达频率降低，在IL-10和TGF-β介导下，CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞免疫抑制功能减弱，引起母胎免疫耐受平衡紊乱，是URSA发病的主要原因之一。
3.URSA蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞对NK细胞的功能调控
分析URSA患者蜕膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞对NK细胞杀伤毒性和NK细胞胞内因子产生的影响，探讨CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞调控NK细胞功能在母胎免疫耐受中的作用。采用FCM法检测URSA组和对照组NK细胞两种亚群的分布；用LDH释放实验测定CD4+CD25+CD127dim/-Treg和NK细胞共培养后NK细胞毒性变化；FCM法测定CD4+CD25+CD127dim/-Treg和NK细胞共培养后NK细胞胞内IFN-γ、Perforin产生情况。结果显示：URSA组蜕膜中CD56+CD16-NK细胞表达频率较对照组明显减少；URSA组活化NK细胞CD3-CD56+CD69+表达频率增加，NK细胞胞内IFN-γ、Perforin的产生明显增多，NK细胞杀伤毒性作用明显高于对照组；CD4+CD25+CD127dim/-Treg对NK细胞功能有抑制作用，URSA组Treg细胞对NK细胞杀伤毒性的抑制作用明显降低，对NK细胞胞内IFN-γ、Perforin的产生抑制作用下降；正常功能Treg细胞可以抑制URSA患者NK细胞毒性至正常水平，功能降低的Treg细胞对正常早孕妇女NK细胞毒性抑制作用也较弱。URSA中Treg细胞数量和免疫抑制功能的下降，引起NK细胞的活化异常和毒性增加，最终导致免疫耐受失衡，流产发生。
我们的研究结果表明：CD4+CD25+CD127dim/-是蜕膜Treg的有效分子标志，CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞和NK细胞在原因不明复发性流产发生时，共同参与母胎界面局部免疫的调节：URSA中Treg细胞数量下降和免疫抑制功能降低，导致NK细胞的异常活化和毒性增加，引起母胎界面免疫耐受状态失衡。这一结论不仅丰富了妊娠免疫耐受理论，而且进一步加深了对妊娠生理过程的认识，也将为研究某些病理性妊娠的发病机制提供新的线索，为制定疾病的防治策略提供依据。当然，妊娠是极为复杂而又受到精细调控的生命现象，必然存在多重机制以确保妊娠的建立和维持，还有待于我们继续探索研究。