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目的:本课题目的是以忠薯1号为原料,从中提取分离出新的活性成分,并对其进行结构鉴定,然后评价其抗肿瘤活性以及机制,为后续研究以及产品开发提供理论依据。方法和结果:1、本课题通过水提取,等电沉淀,色谱和电泳法并通过MTT活性追踪,从忠薯1号中获得了有抗结肠癌活性的糖蛋白。用高效液相色谱(HPLC)和氨基酸分析仪分别鉴定了糖蛋白中糖和蛋白质的组成,并使用BALB/c裸鼠和人结肠癌细胞(HCT-116)探索了其抗肿瘤活性。生物质谱的实验结果显示,从忠薯1号中分离得到的糖蛋白其分子量为56 KD,于是将此化合物命名为SPG-56。SPG-56的相对糖和蛋白质含量分别为2.9%和97.1%,分别含有6种单糖和15种氨基酸。SPG-56所含的6种糖中阿拉伯糖的含量最高,高达0.92%,其次是含量为0.82%的半乳糖,含量最低的是0.17%的葡萄糖醛酸,而甘露糖、半乳糖醛酸和木糖的三者的含量相对来说差别不大,分别为0.21%、0.21%与0.23%。SPG-56中必需氨基酸达42.9%,所有氨基酸中含量丰富的氨基酸有三种,分别是非必需氨基酸谷氨酸和天冬氨酸,以及必需氨基酸缬氨酸,这三种氨基酸的含量分别为14.2%,14.0%和9.5%。2、为了验证SPG-56的抗结肠癌活性,首先选择体外实验,运用MTT检测法剖析了SPG-56影响结肠癌HCT-116细胞株增殖的作用。在MTT实验结果的基础上,选用不同浓度的SPG-56,利用流式细胞技术测定了SPG-56作用于HCT-116细胞24h以后,不同浓度下凋亡细胞的散布情况。我们的研究发现SPG-56对结肠癌细胞HCT-116有一定的抑制作用,并且这种作用不仅仅跟药物的浓度产生了剂量性依赖性,还与药物作用的时间形成时间依赖关系。而且随着SPG-56浓度的增大,细胞的凋亡率也在一定程度上有所增加,我们发现当SPG-56的浓度为80μg/mL时凋亡率达33.6%。因此我们推测,一定浓度下的SPG-56可能是通过诱导结肠癌细胞凋亡从而来实现对结肠癌细胞生长的抑制作用的。3、对于体内实验研究,选用雄性BALB/c裸鼠动物,通过灌胃给药SPG-56,观察和记录实验期间裸鼠的体重和瘤体积的变化趋势。结果显示SPG-56按照150mg/kg的剂量灌胃给药后可明显抑制肿瘤生长,SPG-H(SPG高剂量,150 mg/kg)给药组(373.3±25.3 mm~3)的肿瘤体积明显低于模型组(TC)(827.6±53.4 mm~3)。为了进一步验证动物以及流式实验的结果,我们提取肿瘤组织中的蛋白,采用WB实验分析了组织中凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示SPG-56各给药组的Casepase-3,Casepase-8,Casepase-9,以及Bax的表达随着药物剂量的增加而增高,然而Bcl-2的表达却与之相反,随着药物剂量的增加而降低。与此同时进行了免疫组化的研究,其结果与WB的结果是一致的。这些结果表明,SPG-56可能是一种抑制结肠癌生长的潜在成分。4、基于以上结果,本课题对SPG-56抗结肠癌的机理进行了进一步的研究。对裸鼠的粪便进行了16S DNA序列分析以及短链脂肪酸(SCFAs)的分析。结果显示SPG-56组微生物种类丰富,NC(正常对照)组与LF(Lactobacillus fermentum,发酵乳杆菌)丰度显着高于TC组。而且SPG-56组LF的含量高于NC组与TC组,尤其是SPG-H组。气相色谱与质谱法连用测定粪便中短链脂肪酸的种类,结果显示粪便中含有的短链脂肪酸主要是乙酸、丙酸和丁酸,而且乙酸的相对含量最高,SPG-H组的乙酸含量显著性高于其他组。雄性BALB/c裸鼠的动物实验表明口服给予SPG-56(150 mg/kg),发酵乳杆菌(2×10~8 cfu/0.2 mL)+SPG-56(150 mg/kg),SCFAs(20 mM/0.2 mL)可明显抑制肿瘤生长。综上所述,我们认为从甘薯中提取分离出的一种新的糖蛋白SPG-56具有一定的抗结肠癌作用,它能够一定程度上抑制动物肿瘤的生长,提高肠道微生物物种丰富度,增加发酵乳杆菌的含量,抑制与凋亡有关的蛋白或者基因的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。因此,SPG-56可能可以用来作为一种抗肿瘤药物,这一发现值得进一步的深入研究。