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目的:本研究选择信号转导与转录激活因子3(signal transduction and activators of transcription,STAT3)作为目的基因,构建短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,对肝癌细胞中的stat3基因进行干涉,探讨stat3基因的改变对下游pim-2基因表达的影响。方法:1 STAT3-siRNA表达载体的制备按一定原则设计并合成针对stat3基因的siRNA表达盒(STAT3-SECs)。将纯化好的siRNA表达盒与psiLentGeneTM载体建立连接体系后,取适量连接产物转化至高效感受态细胞Ecoil DH5α中,挑选阳性重组克隆,重组质粒经酶切消化测序鉴定,确认为实验所需质粒。2细胞培养选取人源SMMC-7721肝癌细胞系进行传代培养用于实验。3转染细胞参照转染试剂的操作说明,将STAT3-siRNA表达载体转染至人肝癌细胞。4观察细胞形态变化转染后24小时于倒置光显微镜下观察细胞表象变化。5 RT-PCR TRIZOL提取细胞总RNA,逆转录为cDNA;以cDNA为模板PCR合成pim-2基因片断。以β-actin为内参,凝胶图像分析软件分析,对比pim-2基因表达水平。6 Western Blot将提取的肝癌细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,免疫结合及显影,测定细胞中PIM-2蛋白的表达。以β-actin为内参,凝胶图像分析软件分析,对比PIM-2蛋白表达水平。7应用SPSS统计学软件和方差分析来分析比较各组实验设计,α=0.05为显著性标准。结果:1克隆1.1 siRNA表达盒测序结果经Blast比对证实siRNA所含结构与实验设计的序列相符。1.2重组质粒经酶切鉴定为实验所需表达载体。2细胞形态学观察倒置显微镜下,SMMC-7721对照组细胞数目均增多、贴壁状况良好、细胞多呈梭形或多角形、大小适中铺满整个视野,核仁清晰、可见核分裂相,SMMC-7721空转染试剂组、SMMC-7721空质粒组、SMMC-7721错配链-SECs表达载体组与SMMC-7721对照组相比基本无明显变化。而SMMC-7721 STAT3-SECs表达载体组与SMMC-7721对照组相比细胞数目减少、贴壁状况不好,形态不规则、排列紊乱且有较多漂浮细胞,细胞出现不同程度的皱缩及空泡、核质比率倒置、核分裂相减少,细胞密度下降,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞内可见多个折光性较强的圆形小泡样结构和细胞出芽样改变,细胞间失去正常接触抑制,细胞碎片增加、背景颗粒增多。随着STAT3-SECs表达载体浓度的不断加大,相应的细胞变化程度也随之加大。3 RT-PCR相对于SMMC-7721对照组,SMMC-7721空转染试剂组、SMMC-7721空质粒组、SMMC-7721错配链-SECs表达载体组pim-2基因的相对表达量基本无明显变化;SMMC-7721 STAT3-SECs表达载体组相对于SMMC-7721对照组pim-2基因的表达下调。4 Western Blot相对于SMMC-7721对照组,SMMC-7721空转染试剂组、SMMC-7721空质粒组、SMMC-7721错配链-SECs表达载体组PIM-2蛋白的相对表达量基本无明显变化;SMMC-7721 STAT3-SECs表达载体组相对于SMMC-7721对照组PIM-2蛋白的表达下调。结论:1成功体外合成stat3基因的siRNA表达载体。2 STAT3-siRNA表达载体转染SMMC-7721后,stat3基因表达下调,并下调了pim-2基因表达。3 RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默stat3的治疗策略可能为肝癌治疗提供新的靶点。