背景与目的 慢性心力衰竭是多种心脏疾病的终末阶段所表现出来的一种临床综合征。其中缺血性心脏病特别是心肌梗死为其最常见的病因。心衰的一个重要的病理生理特征为交感过度激活和循环儿茶酚胺蓄积,而这将导致心功能不全的进一步进展与恶化。目前关于心力衰竭时循环儿茶酚胺蓄积的机制仍不完全清楚。而renalase通路的发现给了我们新的启示。作为一种分泌型的单胺氧化酶,renalase可以直接降解循环儿茶酚胺,而儿茶酚胺也可以影响renalase的活性、合成和分泌。本研究的目的即通过构建大鼠单侧肾动脉狭窄和离体肾灌注模型以及心梗后心力衰竭模型,观察肾血流量或灌注压是否对于renalase的合成具有影响,以及心力衰竭时肾脏enalase的合成是否存在缺陷及与循环去甲肾上腺素浓度的关系。方法 1.连续给Sprague-Dawley (SD)大鼠灌胃血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)一周阻断大鼠肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)激活,对照组使用等量生理盐水(normal saline, NS)灌胃以排除RAAS于renalase表达的影响。连续灌胃一周后用0.2mm肾动脉夹造成大鼠单侧肾动脉狭窄模型,ACEI组和NS组分别设立手术组和假手术组。逆转录聚合酶链反应(reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)检测各组大鼠肾脏中的renalase mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组大鼠肾脏中的renalase蛋白质表达水平。2.构建大鼠离体肾灌注模型,并在灌流液中加入20ng/ml去甲肾上腺素,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法动态监测灌流液和尿液中去甲肾上腺素浓度的变化,研究肾脏对于去甲肾上腺素是否有直接的代谢作用,并通过改变灌流量或灌注压研究肾灌流量与肾脏对于去甲肾上腺素清除率的关系。3.SPF级雄性成年S prague-Dawley (SD)大鼠在呼吸机辅助呼吸支持下开胸行冠状动脉左前降支结扎术构建急性心肌梗死模型,并设立假手术组和正常对照组。手术组通过术中观察结扎区心肌变苍白、室壁运动减弱,以及术后3天采用红四氮唑(2,3,4-triphenyltetrazolium chloride dye, TTC)染色法确定造模成功。术后四周行超声心动图、血流动力学检查了解各组大鼠的心功能情况。4.心梗后心衰模型各组大鼠采用ELISA法检测血浆renalase和去甲肾上腺素浓度,RT-PCR和Western blotting分别检测各组大鼠肾脏中的renalase mRNA和蛋白质表达水平,单胺氧化酶活性测定试剂盒检测血浆renalase活性以研究心力衰竭时是否存在renalase合成缺陷及其与血浆去甲肾上腺素浓度的关系。结果 1.在单侧肾动脉狭窄模型中,ACEI组缺血肾与未缺血肾的renalase表达与NS组相比均无统计学差异,从而排除了RAAS对于肾脏renalase表达的影响；而缺血肾与未缺血肾相比,renalase mRNA及蛋白表达水平均较非缺血肾显著下降。2.在离体肾灌注模型中,灌注液中的去甲肾上腺素的浓度随灌注时间的延长逐渐下降；其清除率随着灌注压或灌流量的下降而下降；3.在心梗后心力衰竭模型中,手术组大鼠外周血中的去甲肾上腺素及renalase浓度均较正常对照组及假手术组升高,而其肾脏的renalase蛋白表达水平较对照组明显下降,血浆renalase活性在组间无统计学差异。结论 1.肾脏renalase的表达受肾血流量的影响。2.肾脏对于去甲肾上腺素具有直接的代谢作用。当肾脏灌流量或灌注压下降时,肾脏对于去甲肾上腺素的清除率随之而下降。3.在心力衰竭情况下,肾脏renalase的合成受到损害,这可能代表心力衰竭时循环儿茶酚胺蓄积的新的机制。背景与目的 慢性心力衰竭是多种心脏疾病的终末阶段,鉴于其主要以心肌细胞丢失,残留心肌细胞的功能恶化、继发性的心肌细胞肥大与血管新生的不协调为主要特征,因此促心肌细胞增殖,抑制凋亡,促进血管新生,改善心肌微环境就成为潜在的治疗策略。整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是一种有功能的Ser/Thr蛋白激酶,作为心脏机械牵拉感受器的关键性组成,参与调控细胞的凋亡、增殖、肥大和血管新生。本研究在建立动物扩张型心肌病心力衰竭模型的基础上给予外源性ILK基因转染,旨在探讨ILK基因治疗能否改善心力衰竭动物的心功能,并进一步探讨其可能机制。方法1.采用AdEasy系统构建含ILK基因和人源化绿色荧光蛋白(humanized recombinant green fluorescent protein, hrGFP)报告基因的重组腺病毒,经293细胞扩增和进一步纯化得到实验用重组腺病毒载体。2.SPF级雄性成年SD(Sprague-Dawley)大鼠行阿霉素腹腔注射建立扩心病模型(注射总量为15mg/kg,分六次在两周内注射完成),首次注射后5周行超声心动图检测确认大鼠心脏扩大,EF%、FS%降低,血浆BNP浓度增高为模型构建成功。3.评估ILK重组腺病毒在体转染后表达及活性情况,探讨扩心病后心力衰竭模型转染ILK重组腺病毒是否能缓解左室重构、改善心功能及其可能机制：大鼠超声心动图检测确认扩心病后心力衰竭模型构建成功后,在左心室多点注射ILK重组腺病毒或空载腺病毒,在注射后4周后行超声心动图、血流动力学检查评估心功能,苏木素—伊红(hematoxylin & eosin, H&E)染色法检测心脏形态学,masson三染色法检测胶原沉积情况,TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平,Phospho-histone H3免疫荧光染色评估心肌细胞增殖情况,丙二醛浓度和超氧化物歧化酶活性测定法评估氧化应激水平,血浆肿瘤坏死因子α浓度测定法评估炎症状态。结果1.与空载腺病毒转染组(对照组)相比,ILK腺病毒转染组(ILK组)的心肌组织内ILK和hrGFP表达明显增加,代表ILK活性的pAkt/Akt增高。2.转染4周后,ILK组的心功能、血流动力学、心脏形态学指标均优于对照组。3.ILK组由阿霉素毒性作用引起的炎症细胞浸润和心肌细胞变性明显减轻,心肌细胞凋亡率、胶原容积分数均低于对照组。与对照组比较,ILK组心肌细胞增殖情况明显增加,氧化应激水平及炎症反应程度减轻。结论1.扩心病心力衰竭模型行ILK基因治疗可以缓解左室重构,改善心功能；2.这一作用可能与ILK降低心肌凋亡率、促进心肌增殖和减轻氧化应激水平和炎症反应程度等多种因素有关。