猪圆环病毒2型(Porcine circovurus type 2, PCV2 )不仅可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS),而且还与猪皮炎肾病综合症(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、增生性坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)、猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)、猪先天性震颤(congenital tremors, CT)、繁殖障碍等疾病密切相关。自从1991年加拿大首次报道了PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原以来,PCV2病毒在世界各地迅速蔓延。2000年郎洪武首次报道检测出PCV抗原,之后越来越多的报道证实PCV2病毒在我国的猪场中也有广泛的感染,已给养猪业造成了相当严重的经济损失。临床上PCV2常与猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)等其它一些病原微生物混合感染,而PCV2、PCV1、CSFV、PPV等病毒在PK-15细胞上又不产生细胞病变,给PCV2病毒的分离工作带来一定的困难。2006年暴发的猪高热疫情中,除了高致病性PRRSV,还发现PCV2、PPV、PRV及CSFV混合感染的病例。以往对于PCV2的分离,一般是通过PK-15细胞的传代培养来达到净化的目的,最后靠针对特定病毒的特异性检测鉴定净化的效果。而对于排除其他未知的病毒却没有好的方法。因此本研究在分离鉴定猪高致病性蓝耳病病例中的PCV2病毒过程中,利用PCV2全基因组的感染性建立了一套行之有效的PCV2病毒分离方法。主要内容及结果如下:1.根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型基因序列,选择PCV2基因组上唯一的SacⅡ位点设计一对引物,对29份从2007年5月到2007年11月期间广东4个地区的猪场猪高致病性蓝耳病病例的猪体淋巴结病料应用PCR技术进行了PCV2全基因组扩增,并将4株阳性基因克隆入pMD18-T载体,筛选出阳性重组质粒pMD-PCV2进行测序,并将测序结果与国内外已发表的参考毒株进行序列比对分析。结果表明,分离到的4株PCV2全基因大小相同,都为1767 bp,分别命名为GDYFJ,GDSHJ,GDZQJ,GDBLJ。它们与国内不同地区的分离株全基因组序列同源性差异较大,没有明显的规律。但与3株两广地区的毒株亲缘关系较近,由此可见,这次新疫情中PCV2的变异较小,在引发疫情暴发的因素中更多的可能与PCV2引起感染猪的免疫抑制有关。2.将构建的阳性质粒pMD-PCV2大量制备,用SacⅡ切出PCV2全基因组,体外环化后转染PK-15细胞,利用PCV2全基因组的感染性复制出完整的病毒。通过PCR鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)的方法证明,转染细胞中产生了具有复制活性的病毒颗粒,再运用荧光定量PCR技术筛选出病毒含量较高的细胞,增殖病毒提高病毒的含量和毒力,从而成功地分离获得纯化均一的PCV2毒株。这为进一步开展PCV2感染性的研究,以及进行病毒的免疫和致病机理研究以及病毒的分子流行病学研究奠定了基础。