目的：　　 恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida MT-2)是一类由环境中分离得到对甲苯、二甲苯等芳香类化合物具有降解作用的微生物，其降解活性酶大部分由TOL质粒的xyl基因簇表达，其中二甲苯单加氧酶(xylenemonooxygenase，XMO)和邻苯二酚2、3双加氧酶基因又是该降解途径的关键酶和限速酶。所以本研究通过基因重组和蛋白原核表达技术，将外源的野生降解菌株恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaMT-2)的二甲苯单加氧酶(xylenemonooxygenase，XMO)和邻苯二酚2、3双加氧酶基因重组到大肠杆菌BL21菌株中，并通过IPTG诱导表达得到相关酶蛋白，再运用相关酶活测定方法研究并验证二甲苯单加氧酶和邻苯二酚2、3双加氧酶的功能。本研究为后续通过同源重组继续导入降解途径下游相关基因，构建兼具安全性、稳定性和彻底性的基因工程生物降解菌株进行了探索和奠定良好的基础。　　 方法：　　 一、苯系化合物野生降解菌株PseudomonasputidaMT-2的鉴定分析　　 首先对从台湾菌株保藏中心购买的PseudomonasputidaMT-2从两个方面对菌株做了鉴定：(1)16srDNA鉴定：用细菌16SrDNA通用引物扩增出约1500bp的条带，将该PCR产物与pMD19Tvector连接，构建重组测序载体pMD19Tvector-16srDNA，并转化到大肠杆菌BL21菌株中，摇菌过夜，提取质粒送大连宝生物工程有限公司测序。(2)二甲苯降解能力的检测，即在含不同浓度二甲苯的无机盐培养基进行生长曲线绘制(OD600nm)（图2）。无机盐培养基(MS培养基)的配制为MgSO40.1g，CaCl2·2H2O0.02g，KH2PO40.68g，MnSO4·H2O0.03g，K2HPO41.73g，FeSO4·7H2O0.03g，NH4NO41.0g，加蒸馏水定容至1000ml。　　 二、二甲苯单加氧酶基因的克隆、表达与功能研究　　 pET28a+)-xylMA融合基因原核表达载体的构建、表达与纯化：　　 二甲苯单加氧酶由两个蛋白亚基组成，一个亚基为羟基化蛋白，一个亚基为电子传递蛋白，分别由xylM和xylA基因表达合成。利用PCR方法，以含二甲苯单加氧酶基因的PseudomonasputidaMT-2为模板，扩增基因xylM和xylA并将其分别亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中，构建成表达载体pET28a(+)-xylM和pET28a(+)-xylA，限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。将表达质粒转化EcoliBL21，IPTG诱导其表达，SDS-PAGE分析表达产物。将蛋白粗提取液通过镍(Ni)柱亲和层析分离纯化目的蛋白，SDS-PAGE和WesternBlotting分析纯化的蛋白，最后通过以还原性辅酶Ⅰ(NADH)和细胞色素c为底物的酶活分析来鉴定目的蛋白的活性。　　 三、邻苯二酚2、3双加氧酶基因的克隆、表达与功能研究　　 pET28a(+)-xylE融合基因原核表达载体和pET28a(+)-xylE融合基因原核表达载体的构建、表达与纯化；　　 利用PCR方法，以含xylE基因的PseudomonasputidaMT-2为模板，扩增基因xylE并将其亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中，构建成表达载体pET28a(+)-xylE，限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。将表达质粒转化EcoliBL21，IPTG诱导其表达，SDS-PAGE分析表达产物。将蛋白粗提取液通过镍(Ni)柱亲和层析分离纯化目的蛋白，SDS-PAGE和WesternBlotting分析纯化的蛋白，最后通过以邻苯二酚为唯一碳源的无机盐培养基有氧培养和以邻苯二酚为底物的酶活分析来鉴定目的蛋白的活性。　　 结果：　　 一、PseudomonasputidaMT-2的鉴定：　　 (1)经DNA测序得到一条长1499bp的16SrDNA序列，与GeneBank已提交的序列进行BLAST相似性搜索表明该微生物应归属于假单胞菌属(Pseudomonas)，并用DNAStar进行同源性分析并构建系统进化树，显示与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)同源性最近。(2)实验结果看，所选恶臭假单胞菌可以利用二甲苯作唯一碳源实现稳定增值，含有降解二甲苯的目的基因，可被用作实验提取目的基因。　　 二、二甲苯单加氧酶基因的克隆、表达与功能研究　　 双酶切及测序结果表明原核表达载体pET28a(+)-xylM和pET28a(+)-xylA与设计相符。工程菌BL21/pET28(a+)-xylM和BL21/pET28(a+)-xylA诱导表达后分别可在35KD和40KD处产生特异性表达条带，镍柱亲和层析后目的蛋白含量在80％以上，WesternBlotting结果显示在35KD和40KD处有出现与目的蛋白相同大小的条带。酶活测验显示XYLA蛋白具有较强的[H]电子传递的能力。　　 三、邻苯二酚2、3双加氧酶基因的克隆、表达与功能研究　　 双酶切及测序结果表明原核表达载体pET28a(+)-xylE与设计相符。工程菌BL21/pET28(a+)-xylE诱导表达后可分别在35KD产生特异性表达条带。镍柱亲和层析后目的蛋白含量在90％以上，WesternBlotting结果显示在35KD处有出现与目的蛋白相同大小的条带。酶活分析显示工程菌BL21/pET28(a+)-xylE能利用邻苯二酚为唯一碳源生长，且邻苯二酚2、3双加氧酶能把邻苯二酚降解为黄绿色的2-羟基-粘糠酸半醛(2-HMS)。　　 结论：　　 二甲苯单加氧酶和邻苯二酚2、3双加氧酶等生物降解相关酶基因能在大肠杆菌原核表达体系中表达并具有活性，在本课题的后续研究中，可以尝试将生物降解酶基因通过同源重组的方法重组到大肠杆菌的基因组序列中，构建能高效降解苯系化合物的同源重组菌株，应用于环境中苯系污染物的生物降解，即避免了野生降解菌株对环境的二次污染，同时也能在安全无毒的大肠杆菌中稳定遗传下去。