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目的:急性髓系白血病(AML)恶性程度高、预后差,与其骨髓微环境密切相关。脂肪细胞作为微环境中重要组分,参与白血病发生发展,但有关骨髓原位脂肪细胞的作用研究仍存在诸多盲点。二甲双胍是广泛应用的口服降糖药物,被研究证实可通过抑制脂肪生成,阻断实体肿瘤细胞增殖与转移,但其能否调控白血病骨髓脂肪细胞作用尚未见相关报道。本研究对初发AML及正常者骨髓活检切片进行回顾性分析,运用计算机网格计点法精确定量骨髓脂肪细胞特征,初步探讨骨髓原位脂肪细胞与成人AML难治间的相关性。体外诱导白血病患者骨髓间充质干细胞(MSC)成脂分化,明确其对白血病细胞的化疗保护及可能作用机制;与此同时,给予二甲双胍干预,探讨二甲双胍对脂肪细胞调控白血病细胞抵抗化疗的影响,为白血病靶向治疗提供新思路。方法:(1)建立自主研发计算机网格计点软件,检测61例初发AML患者与71例临床诊断正常者骨髓脂肪细胞特征(含量及大小),比较两组间差异;并依据预后将初发AML患者分为缓解组及难治组,分析骨髓脂肪细胞特征与AML难治性的相关性。(2)将初发AML及正常者骨髓MSC诱导成脂分化,油红染色观察脂肪细胞形态,q RT-PCR检测成脂基因(PPARγ、C/EBPα、FABP4)的表达,验证脂肪细胞形成。(3)构建脂肪细胞与THP-1细胞共培养体系,筛选阿糖胞苷(Ara-c)最佳作用浓度,研究初发AML与正常者骨髓MSC衍生脂肪细胞对白血病细胞化疗敏感性的差别;蛋白芯片技术检测AML骨髓上清上调蛋白并根据调变程度及文献选择脂肪因子;Western Blot结合q RT-PCR验证两组患者骨髓MSC衍生脂肪细胞中调变蛋白表达情况。(4)初发AML患者骨髓MSC诱导形成脂肪细胞,与第19天加入5mmol/L二甲双胍进行干预48h,并设立对照组。油红染色观察两组成脂率,q RT-PCR检测成脂基因PPARγ、C/EBPα、FABP4m RNA表达水平差异;在Ara-c作用下,建立白血病细胞系(THP-1)与脂肪细胞的直接共培养模型,通过细胞计数比较两组对白血病细胞系化疗保护的差异,流式细胞术检测THP-1凋亡变化。(5)收集二甲双胍调节的脂肪细胞上清(met-CM)与未加入二甲双胍脂肪细胞上清(control-CM),上清液与肿瘤细胞常规培养基按不同比例稀释后重悬白血病细胞,同时加入化疗药物Ara-c,48h后研究各比例状态下THP-1的存活数;比较二甲双胍处理与未处理的脂肪细胞对白血病细胞化疗敏感性的影响。(6)Western Blot及q RT-PCR法检测二甲双胍处理前后组脂肪细胞Leptin因子蛋白及m RNA表达水平,明确Leptin在二甲双胍调控白血病脂肪细胞化疗保护中的作用。结果:(1)AML初发患者骨髓脂肪细胞较正常者含量少、体积小(P<0.0001);难治组AML患者骨髓脂肪含量比非难治组减少(P<0.05)。此外,骨髓脂肪含量与患者年龄正相关,与骨髓原始细胞量、性别、BMI均无相关性;(2)在Ara-c的作用下,AML骨髓MSC体外诱导分化的脂肪细胞与THP-1共培养,与正常组相比,THP-1细胞对化疗药敏感性明显降低,细胞存活数显著升高(P<0.001);(3)蛋白芯片技术检测发现AML骨髓上清高分泌脂肪因子Leptin、Resistin和Growth Hormone。而Leptin在初发AML患者骨髓MSC衍生脂肪细胞中表达明显增高(P<0.001);(4)与对照组相比较,AML骨髓MSC衍生脂肪细胞经二甲双胍处理后,成脂率、成脂基因表达水平无明显改变(P>0.05);但与THP-1直接或间接共培养,均可降低THP-1化疗的抵抗性,促进THP-1细胞凋亡(P<0.05);(5)二甲双胍可以降低脂肪细胞Leptin蛋白及m RNA表达水平(P<0.01)。结论:1.AML患者骨髓脂肪细胞含量少,体积小,参与AML化疗抵抗,与其难治性密切相关;异常高分泌的脂肪因子Leptin可能是调控骨髓脂肪细胞保护白血病免受化疗损伤的机制。提示骨髓脂肪细胞可作为初发AML患者预后不良的一个重要因素,深入研究其作用机制可指导临床早期干预治疗。2.二甲双胍可降低AML骨髓脂肪细胞对肿瘤细胞抵抗化疗的保护作用。其可能机制一方面在于降低脂肪上清中脂肪因子Leptin的分泌;另一方面在于降低了脂肪细胞对肿瘤细胞的抗凋亡作用。