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连作障碍是设施农业的常见问题,其引起设施作物土传病害而造成的损失尤为突出。值得注意的是,一些大田作物（如大豆）经过长期连作种植以后,会产生根部土传病害的抑制性土壤。根据病原和拮抗微生物的共同进化理论,长期连作种植措施可以为土壤中病原菌的拮抗型微生物富集提供空间和时间条件。然而,设施农业中关于长期连作土壤形成土传病害抑制性土壤,以及关键作用微生物群落解析等相关研究仍鲜见报道。黄瓜在设施蔬菜产业中占据紧要地位,其连作种植方式可以引发以尖镰孢菌为主要病原菌的黄瓜枯萎病。为了验证长期连作方式同样可以在设施土壤中富集土传病害病原菌的拮抗型微生物、并形成抑制性土壤,自2013年起进行设施黄瓜的长期连作栽培试验,每年春秋两茬种植,并在苗期的固定时间调查黄瓜枯萎病发病情况。在2019年的第13茬时,设施黄瓜枯萎病病情指数经历了短期连作时的高峰值后,回落到初始种植时期的健康水平。为了进一步解析该长期连作过程中微生物群落的动态变化以及病原尖镰孢菌的拮抗型微生物富集情况,采集连作时间7年13茬的设施黄瓜根围土壤,利用实时荧光定量PCR方法和高通量测序技术,研究土壤真菌和细菌群落丰度和多样性的动态变化,并从长期连作第13茬土壤中分离筛选拮抗病原尖镰孢菌且适应设施土壤次生盐渍化环境的土著拮抗型真菌和细菌。同时,为了更进一步挖掘长期连作种植措施所形成的特异性微生物群落资源,以高效脱除镰孢菌属毒素（DON）为目标,在长期连作土壤中寻找相应的新种资源。主要研究结果如下:1.设施黄瓜经过长期连作栽培后,其根围土壤中真菌ITS和镰孢菌属基因组DNA从连作第3茬时的1.8×10~7（拷贝数/g干土）和54（ng/g干土）降至连作第13茬时的4.3×10~6（拷贝数/g干土）和15（ng/g干土）。真菌ITS序列高通量测序文库的OTU数、Chao 1指数、Simpson指数和Shannon指数均随着连作茬数的增加呈现先上升后逐渐降低的趋势。主成分分析结果显示长期连作（连作第11和13茬）与短期连作（连作第3,5,7,9茬）具有明显差异的真菌群落结构相似性。注释可信度和完成度相对最高的真菌目水平物种注释结果表明,随着设施黄瓜连作茬数的增加,Polyporales目、Hypocreales目和Eurotiales目的相对丰度表现出明显上升趋势。进一步的病原尖镰孢菌拮抗型真菌菌株的筛选试验中,初筛的10株真菌均具有一定程度的拮抗作用,且菌株Trametes hirsuta F1,Flavodon flavus F2和Phlebia sp.F6属于上述的Polyporales目,菌株Clonostachys sp.F7,F8属于上述的Hypocreales目,而菌株Penicillium sp.F9和F10属于上述的Eurotiales目。2.设施黄瓜经过长期连作栽培后,其根围土壤中细菌16S r RNA基因丰度变化不明显（1.5×10~9-1.8×10~9拷贝数/g干土）。细菌16S r RNA基因的高通量测序文库的OTU数、Chao 1指数、Simpson指数和Shannon指数均随着连作茬数的增加呈现增加的趋势。主成分分析结果显示长期连作（连作第11和13茬）与短期连作（连作第3,5,9茬）具有明显差异的细菌群落结构相似性。注释可信度和完成度相对最高的细菌目水平物种注释结果表明,随着设施黄瓜种植茬数的增加,Bacillales目和Sphingobacteriales目的相对丰度表现出明显上升趋势。进一步的病原尖镰孢菌拮抗型细菌菌株的筛选试验中,初筛50株细菌中24株具有一定程度的拮抗作用,且菌株Bacillus sp.AB1-AB12和AB17-22,Cytobacillus sp.AB16,以及Lysinibacillus sp.AB23和AB24均属于自上述的Bacillales目。3.长期连作后的设施黄瓜根围土壤中还具有与镰孢菌毒素代谢相关的新种微生物资源。以镰孢菌毒素DON为对象,采用富集初筛法和高效液相色谱（HPLC）复筛法相结合的方式,从设施黄瓜长期连作第13茬土壤中获得2株脱毒效果相对较好的细菌菌株RV12-1-1和JB1-3-2。经多相分类学研究体系鉴定菌株分别为Devosia属和Oerskovia属中的新种模式菌株。基于基因组序列预测中确认的谷胱甘肽转移酶和葡萄糖基转移酶,推测两个细菌新种菌株均可以通过生物降解途径实现DON的脱除。综上所述,长期连作种植可以影响设施黄瓜根围土壤微生物的群落丰度和结构,富集大量具有拮抗病原尖镰孢菌作用的细菌和真菌菌群,从而促进黄瓜枯萎病抑制性土壤的形成。同时,长期连作后的黄瓜根围土壤中还富含大量可降解镰孢菌毒素的细菌新种。因此,长期连作后的设施黄瓜根围土壤具有提供多样的农业有益微生物资源的巨大潜力。