【摘 要】
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利用PCR从芽孢杆菌（Bacillus sp.）的基因组DNA扩增脂肪酶BSL编码的基因片段，将该基因分别克隆到原核表达载体pQE-30和pET22b（+）中构成表达质粒，并分别转化大肠杆菌M15和BL21，经诱导
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利用PCR从芽孢杆菌（Bacillus sp.）的基因组DNA扩增脂肪酶BSL编码的基因片段，将该基因分别克隆到原核表达载体pQE-30和pET22b（+）中构成表达质粒，并分别转化大肠杆菌M15和BL21，经诱导表达后，重组子M15／pQE-30-BSL表现出最高的水解活性，其酶活比原始菌株提高了17.25倍。以此重组菌水解外消旋氟比洛芬乙酯，生成eep达到99％以上的（R）-氟比洛芬，高于原始菌株的89.2％。优化M15／pQE-30-BSL重组菌外源蛋白的表达条件，表明其最佳诱导温度为37℃，诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1mmol／L。同时，对重组菌的高密度培养做了初步研究，最终菌体量为55g（湿重）／L发酵液，酶活为12300U／L发酵液。 重组菌体经超声破壁，上清液通过一步亲和层析纯化，得到电泳单一条带的纯酶，BSL的比活为30.25U／mg蛋白。纯化的酶分别经SDS-PAGE和质谱分析，显示其分子量大小为28 kDa，说明BSL蛋白质由单一亚基组成。以氟比洛芬乙酯为底物，BSL的最适反应温度为55℃，最适反应pH值为9.0，温度稳定范围低于55℃，pH适用范围在7.0-11.0之间。底物特异性显示，BSL的最适底物为对硝基苯酚丁酸酯（pNPC4）。金属离子Ca2+、Mn2+对酶活有明显的增强作用，而Zn2+则对酶活有显著的抑制作用。多数表面活性剂对脂肪酶的活力都有促进作用，尤其以TritonX-100效果最佳，而SDS则对酶有明显的抑制作用。 以重组BSL为催化剂，进行外消旋氟比洛芬的拆分研究。在50℃，pH9.0，氟比洛芬乙酯50mmol／L的条件下，转化至45％-50％左右，得到eep为99.5％的（R）-氟比洛芬，反应的对映体选择E=1013。
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