【摘 要】
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杆状病毒是一类主要感染节肢动物的病毒，其主要感染鳞翅目昆虫。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒科的模式种，其基因组长134Kb，共有154个开放阅读框。病毒DNA的复制是晚期基因转录的先决条件。晚期基因的表达依赖于早期基因及其产物，并通过病毒自身的RNA聚合酶催化晚期基因转录。此外，还需要一类蛋白因子调控其表达，即晚期表达因子（Late Expression Factor, le
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杆状病毒是一类主要感染节肢动物的病毒，其主要感染鳞翅目昆虫。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒科的模式种，其基因组长134Kb，共有154个开放阅读框。病毒DNA的复制是晚期基因转录的先决条件。晚期基因的表达依赖于早期基因及其产物，并通过病毒自身的RNA聚合酶催化晚期基因转录。此外，还需要一类蛋白因子调控其表达，即晚期表达因子（Late Expression Factor, lef）。在体外晚期基因瞬时表达实验中，有19个AcMNPV基因被确定为晚期表达因子。而在所有的19个晚期表达因子中，lef-10是个特例，到目前为止，关于lef-10的研究报导甚少。本研究通过对天然状态下lef-10在Sf9细胞中的表达及定位情况的分析，以及对其功能区的鉴定，为进一步研究lef-10的功能提供一定的理论基础。本实验首先构建了pTriEx-Halef-10质粒，通过表达HaNPV lef-10蛋白，进行western-blot分析，结果显示：HaNPV LEF-10也形成复合体，推测形成复合体这种现象可能是其生理功能所必需的。由于得不到LEF-10单体蛋白而无法获得抗LEF-10的抗体，且本实验制备的抗体由于效价太低而无法使用。我们构建了pTriEx-innateP-lef10-GFP质粒，将重组质粒与bacmid共转染Sf9细胞，得到的重组病毒分别以不同时间间隔再次感染宿主细胞；通过检测GFP，对天然启动子控制下的lef-10进行了表达及亚细胞定位分析，结果显示：在病毒感染细胞早期，lef-10就已开始表达，随着感染时间的推移，LEF-10逐渐向细胞核移动，在晚期和极晚期时相，蛋白成簇聚集在细胞核中。这些结果也进一步说明，在受染细胞核中，LEF-10是作为晚期表达因子发挥功能的，并且推测LEF-10可能对其他基因的转录起一定的调控作用。由于LEF-10在感染细胞晚期可以定位于细胞核中，推测其可能存在着核定位序列NLS。本实验通过构建分别包含截短lef-10基因的十个质粒，对截短的lef-10基因进行表达及亚细胞定位分析，从而确定其存在的核定位序列，结果显示：截短的lef-10中没有可以定位在细胞核的目的蛋白。另外，先前研究表明，LEF-10在Sf9细胞中可以形成复合物，所以推测LEF-10可能是通过与其他蛋白相互作用而进入细胞核的。为了明确其定位机制，需进一步实验来揭示和验证我们的推测。本实验研究了LEF-10形成复合体的广泛性及对生理功能的作用，以及天然状态下lef-10在Sf9细胞中的表达及亚细胞定位，并分析了lef-10可能存在的核定位序列，这为进一步研究lef-10的功能提供了一定的理论基础。
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