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目的:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是牙周炎最重要的病原菌之一,它与牙周炎炎症加重和复发以及全身疾病都密切相关。抗菌肽LL-37具有广谱抗菌活性和调节免疫系统的作用。本研究目的是观察LL-37对角质细胞HaCaT细胞内P.gingivalis ATCC33277生存的影响,研究自噬在上述过程中的作用和可能的分子机制。方法:1、qRT-PCR方法检测LL-37对内化HaCaT细胞P.gingivalis的活菌数量的影响:HaCaT细胞分别转染0.1～2μg LL-37质粒;空白对照组不予处理,阴性对照组转染2μg NC质粒;应用抗生素保护法将感染复数(multiplicity of infection,MOI)100:1的P.gingivalis加入细胞中内化6 h,18 h后提取总RNA。2、Western Blot方法检测P.gingivalis及LL-37对HaCaT细胞自噬的影响:(1)P.gingivalis处理:(1)不同时间:抗生素保护法MOI值100:1 P.gingivalis内化HaCaT细胞,分别于0、6、18、24、48 h后提取总蛋白。(2)不同MOI值:空白对照组,MOI值10:1、100:1、300:1、500:1的P.gingivalis抗生素保护法内化HaCaT细胞6 h,18 h后提总蛋白。(2)LL-37处理:(1)不同浓度:分为空白对照组、阴性对照组、0.1～2μg LL-37组。转染后24 h提取总蛋白。(2)不同时间:转染1μg LL-37/NC质粒,分别于0、6、18、24、48 h提取总蛋白。(3)LL-37与P.gingivalis联合:阴性对照NC组、LL-37组、NC+P.gingivalis组、LL-37+P.gingivalis组,空白对照组;18 h后提取总蛋白。3、qRT-PCR方法检测抑制自噬后观察LL-37对内化HaCaT细胞P.gingivalis活菌数量的影响。分为NC组、LL-37组、3-MA+NC组、3-MA+LL-37组。转染1μg LL-37/NC质粒,P.gingivalis以MOI 100:1内化6 h。qRT-PCR法检测HaCaT细胞内P.gingivalis活菌数量。4、转录组测序预测LL-37对自噬作用的分子机制:分为转染NC质粒的阴性对照NC组和转染1μg LL-37质粒的LL-37组,Illumina平台高通量测序,“真核有参”转录组分析预测两组差异表达基因。qRT-PCR验证自噬相关差异基因的表达。结果:1、过表达LL-37以浓度依赖性降低内化HaCaT细胞的P.gingivalis活菌数量(P<0.01)。1μg LL-37组LL-37表达量最高,细胞内P.gingivalis活菌数量最低,为阴性对照组的0.60倍。2、(1)MOI值100:1的P.gingivalis作用HaCaT细胞以时间依赖性增加LC3-II/LC3-I比值,48 h最高(P<0.01),为对照组3.22倍;p62的表达量在48 h最低(P<0.01),是对照组0.11倍。(2)P.gingivalis以剂量依赖性增加LC3-II/LC3-I比值,降低p62表达量。其中MOI值为500:1时,LC3-II/LC3-I比值最高(P<0.01),为对照组2.55倍,p62表达量最低(P<0.01),为对照组0.58倍。(3)LL-37以剂量依赖性显著增加HaCaT细胞LC3-II/LC3-I比值(P<0.01),降低p62蛋白表达(P<0.01)。1μg LL-37组LC3-II/LC3-I比值最高为对照组2.04倍,p62表达量最低为对照组0.55倍。(4)转染1μg LL-37质粒后,与NC组相比,LC3-II/LC3-I比值从6 h开始上升,24 h最高(P<0.01),为对照组1.70倍;p62表达量逐渐下降,并在24 h表达量最低(P<0.01),为对照组0.60倍。(5)LL-37与P.gingivalis联合处理HaCaT细胞,LL-37+P.gingivalis组的LC3-II/LC3-I比值最高是NC组的2.09倍,是P.gingivalis组的1.36倍;p62蛋白表达量最低是NC组的0.18倍,P.gingivalis组的0.39倍,差异均具有统计学意义(P<0.01)。3、与NC组相比,LL-37组、3-MA+NC组、3-MA+LL-37组的P.gingivalis数量分别是NC组的0.42、0.82、0.68倍,差异均具有统计学意义(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。3-MA+LL-37组P.gingivalis数量为LL-37组P.gingivalis数量的1.63倍,抑制自噬后LL-37对HaCaT细胞内P.gingivalis数量的降低作用明显下降(P<0.01)。4、转录组测序结果表明与NC组相比,LL-37组有6个自噬密切相关的差异表达基因(FC≥2,P<0.05);经qRT-PCR实验验证后发现LL-37高表达显著上调TRIM22和LAMP3 2个自噬相关基因的表达(P<0.01)。结论:过表达LL-37能够减少内化入HaCaT细胞内P.gingivalis活菌数量。LL-37促进HaCaT细胞自噬,并通过这一过程降低细胞内P.gingivalis活菌数量。LL-37可能通过调控TRIM22、LAMP3来促进自噬。