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前言胃癌死亡率在我国恶性肿瘤中居首位,胃镜检查确诊早期胃癌因其有创性和不易操作性难以普遍开展。正常人循环血中存在少量游离DNA,即循环DNA。近年来研究发现许多肿瘤患者循环DNA与正常人相比有很大差异,是一种有潜力的肿瘤标志物。启动子甲基化近年来被认为是肿瘤中抑癌基因改变的主要途径。脆性组氨酸三连体(fragile histidine triad,FHIT)基因是1996年新发现的一个候选抑癌基因,大量研究表明,FHIT基因启动子甲基化与胃癌的发生发展密切相关。本研究对胃癌患者进行血浆中FHIT基因启动子甲基化状态的检测,结合临床病理资料,探讨FHIT基因在胃癌发生发展中的作用和可能的作用机制,利用FHIT基因启动子甲基化为血清学分子标志物,对胃癌进行早期诊断与疗效评估。实验材料与方法一、实验材料1、标本来源(1)实验组:胃癌患者血浆42例(经胃镜和病理确诊),选自中国医科大学附属一院肿瘤外科2007年1月至2007年6月住院患者,未进行手术和放化疗等治疗,年龄在30-70岁之间;(2)对照组:健康志愿者血浆15例(6个月内进行过健康体检,未确诊任何临床疾病),男女各半,年龄在30-70岁之间:2、实验试剂Wizard DNA纯化试剂盒(Promega)Sss I methylase(NEB)Sodium BisuIfite(Sigma S-9000)Hydroquinone(Sigma H-9003)Glyoogen(Sigma G-8751)WizardDNA Clean-Up(Promega)Ex Taq enzyme dNTP(TaKaRa)等。二、实验方法1、甲基化特异性聚合酶链反应血浆的分离——血浆DNA的提取——DNA的亚硫酸氢盐修饰——甲基化及非甲基化引物进行PCR扩增——2.5%琼脂糖凝胶电泳检测——凝胶成像系统下观察并照相;2、对照设置阳性对照为健康志愿者外周血基因组DNA经甲基化酶修饰后的产物,阴性对照以DDW为模板的对照。3、判断标准以甲基化引物扩增出阳性片段(无论非甲基化引物是否扩出阳性片段)作为阳性结果;以非甲基化引物扩出阳性片段(且甲基化引物未扩出阳性片段)作为阴性结果。4、统计处理用SPSS14.0统计软件包进行统计分析。采用x~2检验,Fisher’s检验,P＜0.05表示在统计学上有意义。实验结果1、胃癌患者血浆中FHIT基因甲基化率为30.95%,明显高于健康组,且两组之间差异有统计学意义(P＜0.05);2、随着组织分化程度的增加,甲基化率有下降的趋势,在高、中分化/低、未分化组间差异有统计学意义(P＜0.05);3、FHIT基因启动子甲基化发生率与患者的年龄、性别、肿瘤大小、是否淋巴结转移、临床大体分期及病理类型等临床和病理资料之间无统计学相关性。结论1、FHIT基因启动子甲基化在胃癌组中的发生率较健康对照组中明显升高,提示胃癌患者血浆中FHIT基因启动子甲基化的发生可能是其基因失活而导致肿瘤发生的重要原因;2、随着组织分化程度的增高,FHIT基因启动子甲基化率有下降的趋势,在高、中分化/低、未分化组间差异有统计学意义,从而推测FHIT基因启动子甲基化在胃癌的分化和增殖中起重要作用,并且可能出现在肿瘤恶性转化的关键阶段;3、FHIT基因启动子甲基化有可能作为血清学分子标志物,对胃癌进行早期诊断与疗效评估。