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研究背景及目的:肝细胞癌(HepatocellularCarcinomaHCC,HCC)是全球十大最常见的恶性肿瘤之一,是恶性肿瘤导致癌症死亡的第二大主要原因~([1-2])。近年来,尽管肝癌的外科手术切除以及肝癌综合治疗取得了一定进展,但肝癌的总体五年生存率并未得到明显提高,其主要原因是肝癌的侵袭和远处转移~([3-4])。因此,阐明肝癌侵袭转移的分子生物学机制是肝癌防治研究的重点。真核翻译延伸因子1A1(EukaryoticTranslationElongationFactor1Alpha1,eEF1A1)是触发蛋白质翻译延伸启动的重要蛋白质,研究证实eEF1A1可参与调控细胞生长,细胞周期调控和细胞凋亡等各种细胞生理过程~([5])。另外文献报道eEF1A1在包括肝癌等多种肿瘤细胞中表达明显升高~([6]),且eEF1A1高表达与肿瘤细胞的增殖,侵袭和迁移密切相关~([7-11])。然而,eEF1A1在调控肝癌侵袭和转移过程中的详细机制仍不完全清楚,需要进一步研究。HOXB9是同源盒基因(homeoboxgenes,HOX)家族成员之一。研究报道HOXB9在乳腺癌、肺癌、结肠癌和胃癌等多种肿瘤中呈高表达~([12-15])。另外研究也发现HOXB9高表达与肿瘤血管生成,侵袭,转移以及不良预后有关~([13,15])。HOXB9可以通过诱导上皮向间充质转化(Epithelial-MesenchymalTransitionEMT)促进肿瘤侵袭,并通过加速DNA损伤反应来抵抗化学治疗药物和放射线治疗~([12,15])。我们前期研究表明,HOXB9在HCC中明显高表达,并参与了HCC细胞侵袭和转移的过程~([16])。然而,eEF1A1和HOXB9在肝癌中的表达关系及其两者间是否存在相互作用进而影响肝癌侵袭和转移仍未见报道。本研究首先检测eEF1A1和HOXB9在肝癌组织中的表达情况,并分析其表达与肝癌患者临床病理参数之间的相关性;其次明确eEF1A1和HOXB9在肝癌细胞中的表达情况,并且通过体内外实验探索eEF1A1和HOXB9对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响;最后探究eEF1A1和HOXB9影响肝癌细胞侵袭转移能力的具体机制。方法:1、采用qRT-PCR、免疫组化及Westernblot等实验方法分析156例肝癌组织及对应癌旁组织中eEF1A1和HOXB9的mRNA和蛋白表达水平,并分析肝癌中eEF1A1和HOXB9表达与肝癌患者临床病理参数及其对预后的相关性。2、运用qRT-PCR及WesternBlot实验方法检测正常肝脏细胞(HL-7702)与多种肝癌细胞株(MHCC97h,HCCLM3,SMMC7721,Huh7和HepG2)中eEF1A1和HOXB9的表达情况;构建干扰eEF1A1和HOXB9的质粒,并筛选出最佳干扰效果的eEF1A1和HOXB9质粒;在上述肝癌细胞中转染sh-eEF1A1质粒后,采用WesternBlot实验方法检测HOXB9表达情况,Transwell实验检测肝癌细胞转染后侵袭转移能力的变化;在稳定下调eEF1A1表达的肝癌细胞中同时转染HOXB9过表达质粒,通过Transwell及RTCA实验检测各实验组肝癌细胞的侵袭转移能力的变化;3、采用蛋白质免疫共沉淀实验检测eEF1A1蛋白和HOXB9蛋白是否结合,利用WesternBlot实验方法检测在肝癌细胞中改变eEF1A1的表达后STAT1的总蛋白和核内蛋白的表达变化;在稳定下调eEF1A1表达的肝癌HCCLM3细胞中同时转染STAT1过表达质粒,利用WesternBlot实验方法检测eEF1A1、HOXB9和STAT1的蛋白表达变化,并通过Transwell实验检测各实验组肝癌细胞的侵袭转移能力的变化;在稳定过表达eEF1A1的肝癌HepG2细胞中同时转染sh-STAT1质粒,利用WesternBlot实验方法检测eEF1A1、HOXB9和STAT1的蛋白表达变化,并通过Transwell实验检测各实验组肝癌细胞的侵袭转移能力的变化;4、在肝癌细胞中改变STAT1的表达或者活性后通过WesternBlot实验方法检测HOXB9的蛋白表达变化;利用生物信息学方法预测STAT1在HOXB9的启动子结合区域,并通过荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验验证两者兼得相互作用。结果:(1)eEF1A1和HOXB9在肝癌组织中高表达,且这两个基因的高表达与临床预后不良密切相关。(2)eEF1A1和HOXB9在肝癌细胞系中高表达,且在肝癌细胞中下调eEF1A1的表达后HOXB9的蛋白表达也随之减少,同时降低肝癌细胞的侵袭迁移能力;在肝癌细胞中下调eEF1A1表达导致肝癌细胞侵袭迁移能力的下降可被过表达HOXB9所回复。(3)Co-IP实验证实eEF1A1和HOXB9不直接结合。另外,改变eEF1A1的表达可以调控STAT1总蛋白和核内蛋白。进一步研究发现,STAT1是eEF1A1调控HOXB9表达的关键蛋白。(4)改变肝癌细胞中STAT1的表达或者活性可以调控HOXB9的蛋白表达;生信分析预测STAT1和HOXB9启动子结合区域,荧光素酶报告基因和CHIP实验进一步证明STAT1结合HOXB9的启动子区域C区并上调HOXB9转录水平。结论:在本研究中,我们发现在肝癌组织中eEF1A1和HOXB9的表达上调,并且两者间的表达呈正相关。eEF1A1和HOXB9的过度表达与肝癌患者的不良预后显著相关。此外,体内体外实验证实降低eEF1A1表达可以通过下调HOXB9的表达进而减少HCC细胞的侵袭和迁移。最后,我们证实肝癌细胞中eEF1A1可以通过增强STAT1介导的HOXB9的转录活性进而增加HOXB9的表达。这些结果证明eEF1A1可以通过STAT1信号通路调控HOXB9表达进而促进肝癌细胞侵袭迁移,为预防和治疗肝癌提供了新的治疗靶点。