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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)均能引起猪只出现水样腹泻、呕吐、脱水、食欲不振和精神萎靡等主要临床症状。可见于各年龄段猪群,尤以仔猪感染发病最为严重,并呈现出一定季节性。猪Delta冠状病毒(Porcine deltacorona virus,PdCV)也是近年来新发现的一种感染宿主消化道引起呕吐、水样腹泻和严重脱水等病症的冠状病毒科新成员。2009年该病毒首次在香港猪腹泻粪便中检出。2014年在美国部分市州被鉴别发现后,迅速蔓延至美国其他市州和加拿大等地区。近年来我国多地养殖场腹泻病例中均有PdCV检出,有报道称PdCV流行范围正在逐步扩大,严重影响养猪业。由于PEDV、PdCV和TGEV感染导致病猪出现相似的临床症状,又常呈现混合感染,这给病原的鉴别诊断带来困难。对此本文进行了PEDV、PdCV和TGEV三重RT-PCR检测方法的研究。本研究根据GenBank中PEDV、PdCV和TGEV M、N和S基因保守区合成3对引物,建立3种病原单项RT-PCR方法并合理优化引物浓度和退火温度。同时基于单项RT-PCR方法的前提,在同一反应体中进行PCR扩增,再分别对引物浓度、退火温度、敏感性、特异性和重复性等条件进行优化,成功建立出能同时检测3种病原的三重RT-PCR方法。经优化后的引物浓度分别是PEDV 10pmol/L、PdCV 10 pmol/L和TGEV 20 pmol/L,同时退火温度为53°C时扩增效果最佳。最低检测浓度分别为PEDV 60.96 pg/反应(8.16×103拷贝/反应)、PdCV58.85pg/反应(1.14×104拷贝/反应)和TGEV 102.69 pg/反应(4.32×104拷贝/反应)。同时用上述建立的三重RT-PCR方法检测猪博卡病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪萨佩罗病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪A群轮状病毒、猪大肠杆菌和猪沙门氏菌等都未出现特异性扩增条带。对分别放置1 d、15 d、30 d和60 d的阳性样本同时进行检测,重复试验4次,结果相同。上述成果说明,建立的三重RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性和稳定性。利用建立好的PEDV、PdCV和TGEV三重RT-PCR方法对2015年10月~2016年3月来自四川省和重庆市13个地区21个中小型规模化猪场的196份样品进行检测。实验结果表明,176份腹泻样品中PEDV 57.4%、PdCV 2.8%和TGEV 2.3%,其中PEDV和PdCV混合感染病料3份,阳性检出率为1.7%,结果表明PEDV阳性检出率较高,说明西南地区主要以PEDV感染猪发病。20份健康样品中PEDV和PdCV各1份,阳性检出率为5.0%,未检出阳性TGEV,也没有检出混合感染,说明健康猪存在PEDV和PdCV的隐性感染。另外,三重RT-PCR与单项RT-PCR方法阳性符合率分别为PEDV95.3%、PdCV 100%和TGEV 100%,具有较高可信度,可作为PEDV、PdCV和TGEV鉴别诊断的检测方法。由此可见,本试验建立的PEDV、PdCV和TGEV三重RT-PCR方法可在同一个反应体中完成对该3种猪病毒性腹泻病原的鉴别诊断。为PEDV、PdCV和TGEV 3种病原的实验室检测和流行病学调查提供有效参考和技术支持,同时也对我国西南部分地区猪场该3种病原的流行趋势进行统计分析,为地区猪肠道疾病的防控和监测提供重要依据。