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目的：构建靶向STAT5A基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体,采用RNA干扰技术阻断STAT5A基因的表达,观察其对人肝癌HEPG-2细胞中STAT5A蛋白表达的影响以及细胞生长抑制情况,为针对STAT5A的肝癌基因治疗提供实验依据。方法：设计针对STAT5A基因的RNA干扰靶序列GCTCTGAATTAGTCCTTGCTT和GCGCTTTAGTGACTCAGAAAT,合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸,退火形成双链DNA,通过T4DNA连接酶连接到线性化pYr-2.1-hU6质粒U6启动子下游,构建重组表达质粒p Yr-2.1-STAT5A-shRNA-1和pYr-2.1-STAT5A-shRNA-2。将重组质粒转化用CaCl2法制备的感受态细胞DH5a,经Kanar抗性筛选和CCDB致死基因筛选,挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增,并抽提纯化质粒,然后将抽提的重组质粒进行Xhol单酶切和琼脂糖电泳分析,同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误,即针对STAT5A基因的RNA干扰真核表达载体构建成功。同法构建不针对任何基因的shRNA阴性对照质粒pYr-2.1-HK。用表达绿色荧光蛋白(EGFP)的pYr-2.1-EGFP检测肝癌细胞HEPG-2的转染效率,培养HEPG-2细胞,接种指数生长期细胞于6孔板,将荧光对照质粒pYr-2.1-EGFP以每孔脂质体7.5μl、重组质粒3μg配成转染复合物,加入各孔HEPG-2细胞中进行转染,转染后48h重组质粒上带有的EGFP基因得以表达,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞所占比例,以此来判断转染效率。设置空白组(blank group)、阴性对照组(HK group)、STAT5A-1组、STAT5A-2组,也以每孔脂质体7.5μl、重组质粒3μg配成转染复合物,加入各孔HEPG-2细胞中进行转染(空白组不加任何试剂)。于转染后48h裂解各组细胞提取总蛋白,通过western blot检测各组STAT5A蛋白的相对表达量。同时于转染后1-4d用MTT法检测细胞增殖情况。结果：1.重组质粒pYr-2.1-STAT5A-shRNA-1和pYr-2.1-STAT5A-shRNA-2经XhoI酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点,重组质粒构建成功。2.转染后48h荧光显微镜下观察,根据发绿色荧光的HEPG-2细胞所占比率判断LipofectamineTM 2000转染HEPG-2细胞的转染效率达65%以上。3.免疫印迹western blot分析显示：各组条带中内对照GAPDH(37KD)的亮度相似,而STAT5A(94KD)的亮度STAT5A-1组、STAT5A-2组明显弱于其它二组。灰度扫描半定量结果显示STAT5A-1组、STAT5A-2组、空白细胞对照组、HK对照组HEPG-2细胞中STAT5A蛋白的相对表达量分别为0.362±0.006、0.485±0.004、1.266±0.004、1.267±0.005。经q检验方差分析,STAT5A-1组、STAT5A-2组STAT5A蛋白相对表达量与空白组和阴性对照组相比,分别下降71.4%和61.7%左右,差异有统计学意义(P<0.05),而其它两组之间相比,无显著性差异(P>0.05)。4.MTT实验结果显示：与空白对照组及阴性对照组比较,STAT5A-1组、STAT5A-2组在1～4d范围内细胞生长速度减慢,增殖显著抑制,抑制率均在2～3d(48～72h)达最大值,分别为50%,44.3%,差异有统计学意义(P<0.05)；而空白对照组及阴性对照组之间比较,差异无显著性(P>0.05)。结论：1.设计合成的shRNA干扰序列准确无误地克隆到pYr-2.1-hU6质粒表达载体中,成功构建了靶向STAT5A基因的RNA干扰真核表达载体。2.针对STAT5A基因的RNAi靶序列设计有效,将其转染细胞48h后可显著抑制STAT5A蛋白表达。3.沉默肝癌细胞STAT5基因,可显著抑制人肝癌细胞的生长。