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【研究背景】
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在我国高发，发病率和死亡率在肿瘤中分别位居第四位和第三位，是威胁我国居民健康的重大疾病。目前研究认为，HCC发病是一个多因素参与、多步骤组成的复杂过程，基因突变导致的癌基因激活与抑癌基因失活是导致HCC发生的最常见原因之一。RICH2(Rho-GAP interacting Cdc42-interacting protein 4(CIP4 )homolog 2)，又称为ARHGAP44，在人体多种组织中普遍表达，由于其含有RhoGAP(GTPaseactivating protein)结构域，可通过提高Rho蛋白内在GTP酶活性而加速GTP水解，负性调控RhoGTPases的活性。研究表明，RhoGTPase参与调节细胞极性、基因转录、G1细胞周期进展等一系列生物过程。越来越多证据表明RhoGTPases信号在HCC的发生发展中具有十分重要的作用。RICH2可通过特异性激活促进Rac1和/或Cdc42中GTP水解，发挥多种生物学功能，如调控细胞骨架及极性、消除细胞膜皱褶、保持结肠上皮极化细胞顶端微绒毛结构及参与神经元树突棘形态及突触可塑性的调控。前期，我们课题组在基于激光捕获显微切割技术和AffymetrixGenome-WideSNP6.0基因芯片检测的研究中发现，HCC组织中RICH2基因存在较高频率的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，提示RICH2可能是HCC潜在的抑癌基因。
【目的】
本课题旨在通过组织学、细胞学、动物学与分子生物学实验四个层次，系统分析RICH2在HCC组织中的表达情况及其与HCC发生发展的关系，研究RICH2在HCC增殖与侵袭中的调控作用和可能的分子机制，为阐明RICH2在HCC增殖侵袭中的作用提供理论依据和实验基础。首先，通过免疫组织化学方法检测HCC组织中RICH2蛋白的表达与定位，并分析RICH2与HCC临床特征之间的相关性；其次，通过细胞体外实验，观察RICH2对HCC细胞系增殖、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡等生物学功能的影响；进一步通过动物体内实验，利用裸鼠成瘤实验验证RICH2对HCC增殖的作用；同时，综合利用透射电镜、扫描电镜观察、基因富集分析(GSEA)、基于通路的WesternBlot检测及免疫共沉淀等实验方法探讨RICH2在HCC发生发展中可能的信号通路及分子机制。
【方法】
1.对RICH2在HCC中表达及其与患者临床参数间的相关性进行分析。首先，利用免疫组织化学染色实验，检测93例HCC患者癌与癌旁组织中RICH2表达，统计分析RICH2表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、转移等临床参数间的相关性；其次，利用TheCancerGenomeAtalas(TCGA，371例HCC与50例正常肝脏组织)mRNA数据，分析RICH2在HCC与正常肝组织中表达情况，明确RICH2在HCC中表达是否发生异常。
2.利用体外和体内实验研究RICH2在HCC中的生物学作用。首先，利用qRT-PCR、WesternBlot方法检测RICH2在正常肝细胞系HL-7702和HCC细胞系HepG2、LM3、SK-Hep-1、Huh-7、MHCC-97H中的mRNA与蛋白表达水平，随后选取RICH2表达相对较低的HCC细胞系进行RICH2过表达质粒转染，以建立RICH2过表达细胞模型；选取RICH2表达相对较高的HCC细胞系进行RICH2干扰质粒(shRNA)转染，以建立RICH2干扰细胞模型。其次，分别利用MTT实验与平板克隆形成实验，分析过表达或下调RICH2对HCC细胞增殖的影响；利用流式细胞术分析过表达或干扰RICH2对HCC细胞周期与凋亡的影响；分别用transwell细胞迁移实验及transwell细胞侵袭实验，分析过表达或干扰RICH2对HCC细胞迁移、侵袭能力的影响。最后，用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验，分析RICH2对体内肿瘤生长的影响。
3.RICH2调控HCC增殖与侵袭的分子机制探讨。分别通过电镜观察细胞器与伪足形态改变，用GSEA分析可能的相关通路并用WesternBlot对所预测通路蛋白进行验证，利用蛋白免疫共沉淀验证RICH2与相应信号通路的相互作用。
【结果】
1.RICH2在HCC组织中表达显著降低。免疫组织化学检测RICH2蛋白表达水平证实：癌旁肝组织与HCC组织中RICH2阳性率分别为94.6%(89/93)与64.5%(60/93)，RICH2在HCC组织中表达较癌旁组织显著下降。进一步统计分析表明，RICH2表达与肿瘤大小、分期及是否转移显著负相关；利用TCGA数据分析结果表明：在转录水平，与正常肝组织对照，RICH2在HCC组织中的表达显著降低。
2.RICH2显著抑制HCC细胞增殖及侵袭。qRT-PCR与WesternBlot检测结果显示，RICH2在HCC细胞系HepG2、LM3、SK-Hep-1、Huh-7和MHCC-97H中的mRNA与蛋白表达水平均显著低于正常肝细胞系HL-7702，与HCC临床标本中所得结果一致。同时，在五种HCC细胞中，HepG2与LM3细胞具有相对较低的RICH2表达，而MHCC-97H细胞具有相对较高的RICH2表达，后续细胞功能实验选用HepG2与LM3细胞进行RICH2过表达处理，选用MHCC-97H细胞进行RICH2干扰处理。MTT细胞增殖实验显示，过表达RICH2后，HCC细胞系HepG2、LM3的OD490吸光度值较对照组显著降低，而干扰RICH2后，HCC细胞系MHCC-97H的OD490吸光度值较对照组显著升高，平板克隆形成实验显示，过表达RICH2后，HCC细胞系HepG2、LM3克隆形成能力较对照组显著减弱，而干扰RICH2后，HCC细胞系MHCC-97H克隆形成能力较对照组显著增强，提示RICH2发挥抑制HCC细胞增殖的作用；流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期结果显示，过表达RICH2后，HepG2细胞G1期的细胞数比例显著增加，而位于S期的细胞数比例则下降，LM3细胞具有相同的趋势，但无显著差异；干扰RICH2后，HCC细胞系MHCC-97H细胞周期无显著变化；过表达及干扰RICH2后细胞凋亡率均有所增加，提示RICH2对凋亡无特异作用；transwell细胞迁移实验结果显示，过表达或干扰RICH2后，细胞的迁移能力未发生显著变化；transwell细胞侵袭实验结果表明，RICH2过表达促使侵袭至膜另一侧的HCC细胞数量显著减少，而干扰RICH2后，侵袭至膜另一侧的HCC细胞数显著增多，提示RICH2可抑制HCC细胞系细胞侵袭；裸鼠皮下成瘤实验结果显示，与对照组相比，RICH2过表达显著抑制HCC肿瘤生长。
3.RICH2抑制HCC细胞丝状伪足生长，并且负向调控Cdc42、Rac1及Wnt通路。通过透射电子显微镜观察结果显示，过表达RICH2后，HCC细胞内线粒体、囊泡数量减少；扫描电子显微镜观察结果显示，过表达RICH2后，HCC细胞系丝状伪足数量减少、长度变短、末端吸盘数量减少；而干扰RICH2则呈现相反的实验结果，并且依赖于Cdc42的活性，表明RICH2抑制HCC细胞丝状伪足生长；相关通路的WesternBlot验证结果显示，过表达RICH2后，非磷酸化Cdc42及非磷酸化Rac1蛋白显著上调，下游通路相关蛋白非磷酸化PAK1、磷酸化PAK1没有显著变化，非磷酸化LIMK1蛋白显著上调；另外一条通路非磷酸化RhoA蛋白显著下调、磷酸化RhoA没有显著变化；GSEA分析结果提示，RICH2与Wnt通路显著相关。进一步通过WesternBlot进行验证，结果显示，过表达RICH2后对Wnt通路起抑制作用的Wnt5a蛋白表达显著升高，而β-Catenine蛋白表达显著下降；蛋白免疫共沉淀结果显示，RICH2与Cdc42、Rac1及β-Catenine均可相互作用。
【结论】
1.HCC组织中RICH2分子在mRNA和蛋白水平的表达均显著下调，RICH2表达与HCC肿瘤大小、TNM分期以及是否发生转移显著负相关，提示RICH2可能在HCC中发挥抑癌基因的作用。
2.RICH2抑制HCC细胞增殖和细胞侵袭，可使HepG2细胞进入G1期细胞数比例增加，抑制裸鼠体内成瘤，提示是HCC潜在的抑癌基因。
3.RICH2对HCC细胞丝状伪足起抑制作用，这种抑制作用依赖于Cdc42的活性；RICH2可通过抑制Cdc42、Rac1及Wnt通路活性抑制HCC的增殖和侵袭，从而发挥抑癌作用。
本研究首次证实了在HCC中，RICH2作为一种GAP抑制其增殖与侵袭，是一个新的潜在的抑癌基因，填补了RICH2在HCC中缺乏研究的空白，拓展了GAPs在HCC发生发展中具有重要作用的理论认识，有助于加深对HCC发病机制的理解。
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在我国高发，发病率和死亡率在肿瘤中分别位居第四位和第三位，是威胁我国居民健康的重大疾病。目前研究认为，HCC发病是一个多因素参与、多步骤组成的复杂过程，基因突变导致的癌基因激活与抑癌基因失活是导致HCC发生的最常见原因之一。RICH2(Rho-GAP interacting Cdc42-interacting protein 4(CIP4 )homolog 2)，又称为ARHGAP44，在人体多种组织中普遍表达，由于其含有RhoGAP(GTPaseactivating protein)结构域，可通过提高Rho蛋白内在GTP酶活性而加速GTP水解，负性调控RhoGTPases的活性。研究表明，RhoGTPase参与调节细胞极性、基因转录、G1细胞周期进展等一系列生物过程。越来越多证据表明RhoGTPases信号在HCC的发生发展中具有十分重要的作用。RICH2可通过特异性激活促进Rac1和/或Cdc42中GTP水解，发挥多种生物学功能，如调控细胞骨架及极性、消除细胞膜皱褶、保持结肠上皮极化细胞顶端微绒毛结构及参与神经元树突棘形态及突触可塑性的调控。前期，我们课题组在基于激光捕获显微切割技术和AffymetrixGenome-WideSNP6.0基因芯片检测的研究中发现，HCC组织中RICH2基因存在较高频率的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，提示RICH2可能是HCC潜在的抑癌基因。
【目的】
本课题旨在通过组织学、细胞学、动物学与分子生物学实验四个层次，系统分析RICH2在HCC组织中的表达情况及其与HCC发生发展的关系，研究RICH2在HCC增殖与侵袭中的调控作用和可能的分子机制，为阐明RICH2在HCC增殖侵袭中的作用提供理论依据和实验基础。首先，通过免疫组织化学方法检测HCC组织中RICH2蛋白的表达与定位，并分析RICH2与HCC临床特征之间的相关性；其次，通过细胞体外实验，观察RICH2对HCC细胞系增殖、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡等生物学功能的影响；进一步通过动物体内实验，利用裸鼠成瘤实验验证RICH2对HCC增殖的作用；同时，综合利用透射电镜、扫描电镜观察、基因富集分析(GSEA)、基于通路的WesternBlot检测及免疫共沉淀等实验方法探讨RICH2在HCC发生发展中可能的信号通路及分子机制。
【方法】
1.对RICH2在HCC中表达及其与患者临床参数间的相关性进行分析。首先，利用免疫组织化学染色实验，检测93例HCC患者癌与癌旁组织中RICH2表达，统计分析RICH2表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、转移等临床参数间的相关性；其次，利用TheCancerGenomeAtalas(TCGA，371例HCC与50例正常肝脏组织)mRNA数据，分析RICH2在HCC与正常肝组织中表达情况，明确RICH2在HCC中表达是否发生异常。
2.利用体外和体内实验研究RICH2在HCC中的生物学作用。首先，利用qRT-PCR、WesternBlot方法检测RICH2在正常肝细胞系HL-7702和HCC细胞系HepG2、LM3、SK-Hep-1、Huh-7、MHCC-97H中的mRNA与蛋白表达水平，随后选取RICH2表达相对较低的HCC细胞系进行RICH2过表达质粒转染，以建立RICH2过表达细胞模型；选取RICH2表达相对较高的HCC细胞系进行RICH2干扰质粒(shRNA)转染，以建立RICH2干扰细胞模型。其次，分别利用MTT实验与平板克隆形成实验，分析过表达或下调RICH2对HCC细胞增殖的影响；利用流式细胞术分析过表达或干扰RICH2对HCC细胞周期与凋亡的影响；分别用transwell细胞迁移实验及transwell细胞侵袭实验，分析过表达或干扰RICH2对HCC细胞迁移、侵袭能力的影响。最后，用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验，分析RICH2对体内肿瘤生长的影响。
3.RICH2调控HCC增殖与侵袭的分子机制探讨。分别通过电镜观察细胞器与伪足形态改变，用GSEA分析可能的相关通路并用WesternBlot对所预测通路蛋白进行验证，利用蛋白免疫共沉淀验证RICH2与相应信号通路的相互作用。
【结果】
1.RICH2在HCC组织中表达显著降低。免疫组织化学检测RICH2蛋白表达水平证实：癌旁肝组织与HCC组织中RICH2阳性率分别为94.6%(89/93)与64.5%(60/93)，RICH2在HCC组织中表达较癌旁组织显著下降。进一步统计分析表明，RICH2表达与肿瘤大小、分期及是否转移显著负相关；利用TCGA数据分析结果表明：在转录水平，与正常肝组织对照，RICH2在HCC组织中的表达显著降低。
2.RICH2显著抑制HCC细胞增殖及侵袭。qRT-PCR与WesternBlot检测结果显示，RICH2在HCC细胞系HepG2、LM3、SK-Hep-1、Huh-7和MHCC-97H中的mRNA与蛋白表达水平均显著低于正常肝细胞系HL-7702，与HCC临床标本中所得结果一致。同时，在五种HCC细胞中，HepG2与LM3细胞具有相对较低的RICH2表达，而MHCC-97H细胞具有相对较高的RICH2表达，后续细胞功能实验选用HepG2与LM3细胞进行RICH2过表达处理，选用MHCC-97H细胞进行RICH2干扰处理。MTT细胞增殖实验显示，过表达RICH2后，HCC细胞系HepG2、LM3的OD490吸光度值较对照组显著降低，而干扰RICH2后，HCC细胞系MHCC-97H的OD490吸光度值较对照组显著升高，平板克隆形成实验显示，过表达RICH2后，HCC细胞系HepG2、LM3克隆形成能力较对照组显著减弱，而干扰RICH2后，HCC细胞系MHCC-97H克隆形成能力较对照组显著增强，提示RICH2发挥抑制HCC细胞增殖的作用；流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期结果显示，过表达RICH2后，HepG2细胞G1期的细胞数比例显著增加，而位于S期的细胞数比例则下降，LM3细胞具有相同的趋势，但无显著差异；干扰RICH2后，HCC细胞系MHCC-97H细胞周期无显著变化；过表达及干扰RICH2后细胞凋亡率均有所增加，提示RICH2对凋亡无特异作用；transwell细胞迁移实验结果显示，过表达或干扰RICH2后，细胞的迁移能力未发生显著变化；transwell细胞侵袭实验结果表明，RICH2过表达促使侵袭至膜另一侧的HCC细胞数量显著减少，而干扰RICH2后，侵袭至膜另一侧的HCC细胞数显著增多，提示RICH2可抑制HCC细胞系细胞侵袭；裸鼠皮下成瘤实验结果显示，与对照组相比，RICH2过表达显著抑制HCC肿瘤生长。
3.RICH2抑制HCC细胞丝状伪足生长，并且负向调控Cdc42、Rac1及Wnt通路。通过透射电子显微镜观察结果显示，过表达RICH2后，HCC细胞内线粒体、囊泡数量减少；扫描电子显微镜观察结果显示，过表达RICH2后，HCC细胞系丝状伪足数量减少、长度变短、末端吸盘数量减少；而干扰RICH2则呈现相反的实验结果，并且依赖于Cdc42的活性，表明RICH2抑制HCC细胞丝状伪足生长；相关通路的WesternBlot验证结果显示，过表达RICH2后，非磷酸化Cdc42及非磷酸化Rac1蛋白显著上调，下游通路相关蛋白非磷酸化PAK1、磷酸化PAK1没有显著变化，非磷酸化LIMK1蛋白显著上调；另外一条通路非磷酸化RhoA蛋白显著下调、磷酸化RhoA没有显著变化；GSEA分析结果提示，RICH2与Wnt通路显著相关。进一步通过WesternBlot进行验证，结果显示，过表达RICH2后对Wnt通路起抑制作用的Wnt5a蛋白表达显著升高，而β-Catenine蛋白表达显著下降；蛋白免疫共沉淀结果显示，RICH2与Cdc42、Rac1及β-Catenine均可相互作用。
【结论】
1.HCC组织中RICH2分子在mRNA和蛋白水平的表达均显著下调，RICH2表达与HCC肿瘤大小、TNM分期以及是否发生转移显著负相关，提示RICH2可能在HCC中发挥抑癌基因的作用。
2.RICH2抑制HCC细胞增殖和细胞侵袭，可使HepG2细胞进入G1期细胞数比例增加，抑制裸鼠体内成瘤，提示是HCC潜在的抑癌基因。
3.RICH2对HCC细胞丝状伪足起抑制作用，这种抑制作用依赖于Cdc42的活性；RICH2可通过抑制Cdc42、Rac1及Wnt通路活性抑制HCC的增殖和侵袭，从而发挥抑癌作用。
本研究首次证实了在HCC中，RICH2作为一种GAP抑制其增殖与侵袭，是一个新的潜在的抑癌基因，填补了RICH2在HCC中缺乏研究的空白，拓展了GAPs在HCC发生发展中具有重要作用的理论认识，有助于加深对HCC发病机制的理解。