霉菌生长的过程中产生的次级代谢产物——霉菌毒素是污染饲料、食品的主要元凶。我国饲料霉菌毒素污染普遍,这些毒素主要是呕吐毒素、烟曲霉毒素和玉米赤酶烯酮。其中,脱氧雪腐镰刀菌烯醇属单端孢霉烯B族化合物,是镰刀菌产生的一种真菌毒素,在大自然中广泛存在,主要污染谷物及其制品。霉菌毒素的脱毒方法,主要分为三类：物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法。物理脱毒法与化学脱毒是传统意义上的脱毒方法,也是现在应用最广的方法,但是存在着损失饲料中营养元素,且不能根除毒素的缺点。生物脱毒法是近年来研究较多的一种脱毒方法,具有在温和条件下降解霉菌毒素、无需使用有害的化学试剂、不影响适口性、无营养物质流失的优点。近年来的研究发现,瘤胃及土壤中的一些微生物可以产生环氧化物水解酶,通过去除环氧化作用而降低单端孢霉烯族毒素的作用。本试验室从土壤中分离出一株可以转化DON的塔宾曲霉,命名为NJA-1。本试验将扩增出NJA-1菌的DON降解酶基因,并且与表达质粒pET-32a(+)重组,使用重组质粒pET-EHse转化BL21,获得含有重组质粒的大肠杆菌。研究融合蛋白的活性及影响酶活的相关条件,得出最适反应条件,为融合蛋白降解DON打下基础。试验一：NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆与原核表达载体的构建通过提取NJA-1菌中的总RNA,用RT-PCR的方法,得到NJA-1菌中DON降解酶的基因片段,构建原核表达载体pET-EHse,转化到E.coli BL21。试验结果表明,通过RNAisoTM Plus匀浆法得到的NJA-1的总RNA,完整性较好,对下游试验无影响。使用primer 5.0设计出的一对引物EHa1、EHa2可以特异性地扩增出DON降解酶基因片段。通过双酶切、连接与转化,得到含有重组质粒pET-EHse的Kcoli BL21.试验二：融合蛋白sEH的表达及分析与纯化利用IPTG诱导含有重组质粒pET-EHse的E.coli BL21,使其表达融合蛋白sEH。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析细胞总蛋白、培养基、细胞周质、细胞可溶部分及细胞不溶部分中融合蛋白的含量,确定融合蛋白的表达部位。并通过Ni柱亲合层析的方法,对融合蛋白进行纯化。试验结果表明,融合蛋白主要在细胞周质内。当IPTG终浓度为0.4 mol·L-1,25 ℃,培养16 h,可获得较多的可溶蛋白,且蛋白表达量可达2.3g·L-1菌液。使用Ni柱纯化可溶蛋白,可获得高纯度的融合蛋白。试验三：融合蛋白sEH性质的初步研究用冷冻与溶菌酶处理法提取融合蛋白,并且用Ni柱纯化提取的融合蛋白,透析后进行融合蛋白sEH性质的初步研究。试验结果表明,EH的最适pH值为7.0,在pH6.5-7.5范围内酶较稳定；最适反应温度为35℃,且在4℃-30℃范围内有较好的热稳定性；有机溶剂乙腈对酶活具有促进作用；Cu2+可以显著地促进酶活,可以作为该酶的激活剂,Mn2+也可促进酶活。