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隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人兽共患机会性肠道寄生原虫,可感染人、牛、养、猪、猫、犬等260多种动物,能引起宿主自限性腹泻甚至死亡,目前尚无有效防控隐孢子虫病药物和疫苗。目前已鉴定出至少41个隐孢子虫有效种和70多个基因型。在20多种可感染人的隐孢子虫有效种中,研究最多且感染宿主范围广、具显著人兽共患意义的是微小隐孢子虫,在我国流行的微小隐孢子虫优势亚型为Ⅱd亚型。研究报道,隐孢子虫是仅次于轮状病毒的第二大腹泻病原,对人类公共安全构成重大威胁。微小隐孢子虫感染宿主上皮细胞后通过改变其miRNAs的变化实现宿主上皮细胞与微小隐孢子虫之间的相互作用。前期试验证明:微小隐孢子虫感染HCT-8细胞后,TLR2、TLR4等表达水平显著上调,且miRNAs表达谱有显著变化,如Hsa-miR-181d表达水平显著下调。为了解Hsa-miR-1 81d在微小隐孢子虫和宿主细胞之间中的作用,本试验研究了微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期Hsa-miR-181d及TLRs/NF-κB信号通路的相互关系,并对预测的Hsa-miR-181d靶基因即抑制细胞凋亡的Bcl-2进行了验证,以期获取虫体和宿主相互作用的关键分子,为有效药物和疫苗的开发等提供参考。1.qPCR和Western blotting检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期TLRs/NF-κB信号通路关键分子如TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表达。qPCR和Western blotting检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期TLRs/NF-κB信号通路关键信号分子mRNA和蛋白的表达水平,结果证实微小隐孢子虫感染HCT-8细胞0h、4h、8h、12 h、24 h 后TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 和蛋白表达水平有显著上调,其中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平均在在8h和24 h显著升高,MyD88的mRNA和蛋白表达水平在8h和12 h显著升高,表明微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后通过激活TLR4、MyD88、NF-κB等信号分子激活MyD88依赖型TLRs/NF-κB信号通路,参与防御微小隐孢子虫的感染。2.qPCR检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期抑制TLR2、TLR4前后Hsa-miR-181d的变化及流氏细胞仪检测隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞的凋亡情况。微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后Hsa-miR-181d在4h、8h、12 h的表达水平显著下调,且12h下调极其显著,在48 h显著上调。siTLR2、siTLR4转染HCT-8细胞后,Hsa-miR-181d在4h、8h、12 h、24h表达水平均上调,在48 h表达下调,正好与抑制TLR2、TLR4前的结果呈相反趋势,说明TLR2和TLR4参与调控Hsa-miR-181d的表达。且微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后,细胞凋亡在12 h达到底峰,在48 h到达高峰期。以上结果说明:微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后TLRs/NF-κB信号通路参与调控Hsa-miR-181d的表达,且Hsa-miR-181d与细胞凋亡之间有潜在的相互作用。3.通过双荧光素酶试验初步验证Hsa-miR-181d和预测的靶基因B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的关系,并转染Hsa-miR-1 81d的模拟物及抑制剂后通过qPCR和Western blotting从基因和蛋白水平分别检测Bcl-2表达水平。构建含Hsa-miR-181d潜在靶基因Bcl-2的3’UTR的双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-Bcl-2-wild)及其突变型载体(pmirGLO-Bcl-2-mut),初步通过双荧光素酶试验证明Hsa-miR-181d与Bcl-2之间存在潜在的靶向关系;然后使用转染试剂Lipofectamine(?)3000 将 Hsa-miR-181d 的模拟物(mimics)和阴性对照(Negative Control,NC)以及Hsa-miR-181d的抑制剂(inhibitor)及其对应的阴性对照NC共转染HCT-8细胞,qPCR和Western blotting从基因和蛋白水平分别检测Bcl-2表达水平的变化,与mimics NC组相比,miR-181d的mimics组Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著减少,抑制剂组则正好相反,表明Bcl-2为Hsa-miR-181d的靶基因。综上所述,微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后激活MyD88依赖型TLRs/NF-κB信号通路,且抑制TLR2、TLR4前后,Hsa-miR-181d的表水平呈相反趋势,说明TLRs/NF-κB信号通路参与调控Hsa-miR-181d的表达。微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后,细胞凋亡在12 h显著下降,在48 h到达高峰期。且Bcl-2为Hsa-miR-181d的靶基因,Bcl-2与Hsa-miR-181d之间存在负性靶向关系。因此,微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后,激活TLRs/MyD8/NF-κB信号通路,该通路参与调控Hsa-miR-181d的表达,进一步负向调控Bcl-2对细胞的抗凋亡作用,最终导致宿主细胞呈现前期抗凋亡后期促凋亡的双相调节,以此实现抵御微小隐孢子虫的感染。