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破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或称Osteoprotegerin,OPG)是一种调节骨吸收的分泌型糖蛋白。这种糖蛋白称为骨保护素,是肿瘤坏死因子受体超家族的一员,具有降血钙和防止骨质流失的作用。目前OPG主要通过CHO细胞来表达,但其表达量较低。所以我们尝试利用基因工程的方法,探索一种或几种有效的表达系统用以大量制备具有生物活性的OPG。
为了提高OPG的表达量,本研究通过融合家蚕杆状病毒多角体蛋白(Polyhedrin)分别在大肠杆菌和家蚕细胞中表达了OPG。首先,以重组病毒Bm-OPG DNA为模板,进行PCR扩增获得OPG基因。构建重组质粒pBacPAK8-OPG、pBacPAK8一Polh-OPG、pET-32a-OPG和pET-32a-Polh-OPG。将原核表达质粒pET-32a-Polh-OPG转化大肠杆菌BL21并诱导表达,以pET-32a-OPG为对照,分析其表达量。结果显示,在大肠杆菌中融合了Polh的OPG表达量明显提高。表达后的融合蛋白Polh-OPG以包涵体形式存在,经变性处理后用Ni2+亲和柱纯化,SDS-PAGE及Western blotting鉴定得到较纯蛋白。利用小鼠降血钙实验检测融合蛋白Polh-OPG的活性,结果表明Polh-OPG能够显著降低小鼠血清钙离子浓度,具有一定的生物活性。其次,为了分析融合蛋白Polh-OPG在家蚕细胞中的表达效果,我们构建了转移载体pFastBacHTb-Polh-OPG。利用Bac-to-Bac表达系统得到重组Bacmid-Polh-OPG,将其转染家蚕细胞后获得重组病毒Bm-Polh-OPG。Western blotting分析融合蛋白Polh-OPG与OPG的表达量差异。结果表明,融合蛋白Polh-OPG与OPG在家蚕细胞中的表达差异不明显。我们用同样的方法将以包涵体形式存在的融合蛋白Polh-OPG经变性处理后,用Ni2+亲和柱纯化,得到较纯的重组蛋白。小鼠降血钙实验表明在家蚕细胞中表达的Polh-OPG具有一定的生物活性。
本研究为探索如何进一步提高OPG的表达量奠定了一定的基础。