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前言艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的免疫缺陷性疾病,目前尚无治愈手段,疫苗的研究也始终未有突破,根本原因在于对HIV生物学和人体免疫应答机制及两者之间的相互作用关系等科学问题缺乏本质上的理解和认知,特别是对免疫系统中起关键调控作用的因子作用仍知之甚少。在免疫系统中,NKT细胞(natural killer T cell)表达恒定T细胞受体(TCR)αβ,可活化T细胞、B细胞、NK细胞,是天然免疫和适应性免疫之间的桥梁,为免疫系统中重要的调控细胞之一。因此,尽管其数量较少(人类约占外周血单个核细胞的0.01-1%),但在抗病毒、细菌、真菌和寄生虫、抗肿瘤及自身免疫病中均发挥了重要作用,其在HIV感染中的作用也日益引起重视。国外研究显示,NKT细胞高表达CCR5,占T淋巴细胞百分率在急性HIV感染期显著减少,且随疾病进展数量不断下降。近期研究显示,用NKT细胞特异性抗原α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-GalCer)做HIV DNA疫苗佐剂可显著提高HIV特异性T细胞及中和抗体反应。上述研究结果提示,NKT细胞在HIV感染疾病进程中可能发挥重要作用。中国人群和欧美人群遗传背景不同,由其影响的细胞数量及表面分子表达水平可能存在差异,目前尚无HIV感染不同疾病进展阶段NKT细胞数量变化和中国HIV感染者NKT细胞及其亚型数量、CCR5表达水平的报道。本研究用Vα24+Vβ11+CD3+定义NKT细胞,研究中国HIV感染者不同疾病进展阶段NKT细胞及其亚型数量、CCR5表达水平及与HIV感染者疾病进程的相关性,为HIV免疫致病研究提供新的思路。材料和方法1、研究对象53例未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者均来自中国河南,其中男性26例,女性26例,年龄分布为30-68岁(40.7±9.2),所有患者均经Genelab公司蛋白印迹试剂盒确认为HIV抗体阳性。根据HIV感染时间和CD4+T细胞数量将上述患者分为HIV感染缓慢进展组(SP组,感染时间＞10年,CD4+T细胞＞500个/μl)、典型进展HIV组(HIV组,CD4+T细胞介于200-500个/μl之间,无艾滋病指征性疾病)和典型进展AIDS组(AIDS组,CD4+T细胞＜200个/μl或出现艾滋病指征性疾病)。53例HIV/AIDS患者中SP组12例、HIV组28例、AIDS组13例。健康对照组为19例随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人,性别、年龄均与HIV/AIDS患者匹配,平均年龄为24-60岁(32.5±12.2),其中男性10名,女性9名。2、T细胞、NK细胞绝对值检测T绝对值依据1997年美国CDC关于HIV感染者CD4+T细胞检测指导方法,应用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式细胞仪MULTISET软件检测。将20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP试剂加入绝对计数管中,经反向加样法加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACSMULTISET软件检测并进行自动分析,计算CD3+T/CD4+T/CD8+T淋巴细胞绝对值。将20μl CD45FITC/CD16+56+PE/CD3PerCP试剂加入绝对计数管中,经反向加样法加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACS MULTISET软件检测并进行自动分析,计算NK细胞绝对值。3、NKT细胞及其亚型绝对值、表面CCR5表达水平的检测密度梯度离心法分离HIV感染者及健康人PBMC。向流式管中加入2x10~6PBMC及以下荧光标记的单抗进行染色:anti-Vα24-FITC、anti-Vβ11-PE、anti-CD3-PerCP、anti-CCR5-APC、anti-CD4-PE-Cy7,混匀后室温避光30分钟。用PBS洗涤后加入含1%多聚甲醛的PBS重悬,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC定义淋巴细胞、CD3-PerCP、Vα24-FITC、Vβ11-PE定义NKT细胞,计算NKT细胞占CD3+T细胞的百分比、CD4+/CD4-NKT细胞亚型占总NKT细胞的百分比及其CCR5的表达率。NKT细胞绝对值由其占CD3+T细胞的百分比乘以CD3+T细胞绝对值获得。4、统计学分析应用SAS9.0软件包进行统计学分析。不同疾病进展阶段HIV感染者NKT细胞及其亚型数量、CCR5表达水平等用多个独立样本两两比较的Nemenyi法进行比较,NKT细胞数量与疾病进程相关性采用Spearman秩相关检验,P＜0.05视为具有统计学意义。实验结果1、HIV/AIDS患者NKT细胞及其亚型水平通过检测外周血中NKT细胞数量发现,HIV/AIDS患者NKT细胞数量显著低于健康对照组(P＜0.05),AIDS组、HIV组、SP组、健康对照组NKT细胞均数依次上升,其中AIDS组显著低于健康对照组(P＜0.05)。HIV/AIDS患者CD4+NKT细胞数量显著低于健康对照组(P＜0.05),其中AIDS组显著低于SP、HIV组和健康对照组(P＜0.05),SP、HIV组和健康对照组之间无显著差异。HIV/AIDS患者CD4-NKT细胞数量显著低于健康对照组(P＜0.05),其中AIDS组显著低于健康对照组(P＜0.05)。不同疾病进展阶段HIV/AIDS患者NKT细胞占T淋巴细胞的百分率,CD4+/CD4-NKT细胞的比值,随疾病进展有降低趋势,但无显著差异。2、NKT细胞及其各亚型CCR5的表达率HIV组及AIDS组患者CD4+CCR5+NKT细胞占NKT细胞百分率显著低于健康对照(HIV组:1.23±2.34%;AIDS组:0.61±1.23%;健康对照:1.64±2.22%)。HIV/AIDS患者CCR5+NKT细胞中,CD4+NKT细胞的百分率(32±14%)显著低于CD4-NKT细胞(62±25%)(P＜0.05)。HIV/AIDS患者NKT细胞CCR5表达率为9.57±12.97%,与健康对照(5.64±5.54%)无显著差异,CD4+NKT细胞CCR5表达率为4.42±7.16%,与健康对照(3.59±4.41%)无显著差异(P＞0.05)。3、NKT细胞及其亚型与疾病进展的相关性HIV/AIDS患者NKT细胞与CD4+T细胞显著正相关(r=0.33,P＜0.05),CD4+NKT细胞与CD4+T细胞呈显著正相关(r=0.51,P＜0.001),CD4-NKT细胞与CD4+T细胞无显著相关,CD4+NKT细胞与CD4-NKT细胞呈显著正相关。HIV/AIDS患者NKT细胞与CD4/CD8的比值显著正相关(r=0.32,P＜0.05)。结论1、中国HIV/AIDS患者NKT细胞数量在疾病末期显著下降,与疾病进展相关。2、中国缓慢进展者维持高水平NKT细胞数量可能为其疾病缓慢进展的原因之一。