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五酯片为五味子的乙醇提取制剂,具有抗肝细胞损伤作用,临床上用作保肝护肝药物使用。环孢素A和他克莫司,均为细胞色素P4503A和P-糖蛋白的底物,是临床上常用的免疫抑制剂,广泛用于预防器官移植术后排斥反应的发生。临床上,五酯片常用作器官移植病人的保肝护肝药物与环孢素A和他克莫司联合使用,以防治免疫抑制剂所致的药源性肝损害。本实验室前期研究结果表明,在肾移植病人中,五酯片合用他克莫司后,五酯片可以显著提高CYP3A和P-gp的底物他克莫司的血药浓度。那么,五酯片是否能对同样是CYP3A和P-gp底物的环孢素A产生相同的作用呢?能否获得五酯片影响CYP3A与P-gp活性的直接证据呢?
因此,本课题拟在整体动物水平探讨五酯片对不同剂量环孢素A药代动力学的影响,考察五酯片通过影响CYP3A与P-gp的活性而影响环孢素A的血药浓度的程度。另外,本课题通过使用经典的CYP3A与P-gp阳性探针药,评价五酯片同时对CYP3A与P-gp活性的影响,从而获得五酯片影响CYP3A与P-gp活性的直接证据,为临床上五酯片与CYP3A与P-gp底物药物的合理用药提供科学数据。
一、建立和确证生物样品中环孢素A检测的LC-MS/MS方法
目的:建立并确证生物样品中环孢素A的LC-MS/MS检测方法。
方法:采用液相色谱-串联质谱方法检测全血中环孢素A的血药浓度。生物样品采用硫酸锌溶液及乙腈两步沉淀蛋白后进行乙酸乙酯液-液萃取法抽提。离子源为电喷雾离子化源(ESI);检测方式为正离子检测;扫描方式采用选择反应监测(SRM)。色谱分析柱为C18 xTerra MS分析柱(3.5μm,2.1×50 mm Waters,USA);流动相为甲醇-水(含10 mM醋酸铵)(80∶20,v/v);流速为200μL/min;柱温为60℃;分析时间为3 min。
结果:用于定量分析环孢素A的离子反应分别为m/z1219.9→1203.6(CsA)和m/z809.8→756.6(FK520,内标)。本分析方法中环孢素A的线性范围为20~2000ng/mL,方法定量下限为20 ng/mL,生物样品中环孢素A的线性相关程度良好(γ2均大于0.99)。以质控样品计算该分析方法的批内精密度RSD在3.1%~6.3%范围内,批间精密度RSD在6.0%~11.3%范围内;生物样品的提取回收率在47.8%~53.0%范围内。各项稳定性考察结果表明环孢素A在所设定实验条件下稳定。
结论:该分析方法经方法学确证结果满意,样品处理及检测过程快速、可靠,可满足环孢素A临床前药代动力学研究的要求。
二、五酯片对大鼠体内环孢素A药动学的影响
目的:在整体动物水平探讨五酯片对不同剂量环孢素A药代动力学的影响,考察并比较五酯片对环孢素A和他克莫司血药浓度影响程度的异同。
方法:雄性SD大鼠随机分组后,分别灌胃给予蒸馏水、五酯片混悬液(0.25 g/kg)或地尔硫卓混悬液(8.1 mg/kg,对照组),再灌胃给予环孢素A(37.8、1.89mg/kg)。采用LC-MS/MS法测定环孢素A的血浆浓度,用非房室模型法计算各主要药代动力学参数,并进行统计分析。
结果:单次灌胃给予五酯片使口服环孢素A(37.8 mg/kg)的AUC0-48h增加40.1%,Cmax增加13.1%,CL/F从0.6 L/h/kg降低至0.4 L/h/kg。地尔硫卓对口服环孢素A(37.8 mg/kg)的主要药代动力学参数Cmax、AUC、CL/F影响无统计学差异。单次灌胃给予五酯片使口服环孢素A(1.89 mg/kg)的AUC0-36h增加293.1%,Cmax增加84.1%,CL/F从1.7 L/h/kg降低至0.5 L/h/kg。单次灌胃地尔硫卓使口服环孢素A(1.89 mg/kg)的AUC0-36h降低37.3%,Cmax降低33.7%、CL/F从1.7 L/h/kg增加至3.8 L/h/kg。
结论:五酯片通过影响CYP3A与P-gp的活性来影响环孢素A的血药浓度,五酯片对降低剂量环孢素A的血药浓度及药代动力学参数影响更为显著。
三、同时评价体内细胞色素P4503A和P-糖蛋白活性模型的建立与确证此部分重在建立两种经典CYP3A和P-gp探针的检测方法并在动物体内验证此模型。
一)、同时检测CYP3A和P-gp探针的LC-MS/MS检测方法
目的:建立同时检测咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑、地高辛的灵敏、特异、可靠的LC-MS/MS定量分析方法。
方法:采用液相色谱-串联质谱方法检测大鼠血浆中咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑和地高辛的浓度。大鼠血浆样品加氨水碱化后并采用提取剂(叔丁基甲醚∶二氯甲烷=3∶1)进行液液萃取。离子源为电喷雾离子化源(ESI);检测方式为正离子检测;扫描方式采用选择反应监测(SRM)。色谱分析柱为C18 XTerra MS分析柱(3.5μm,2.1×50 mm,Waters,USA);流动相为甲醇-水(含5 mM甲酸铵+0.1%甲酸)(80∶20,v/v);流速为200μL/min;分析时间为3 min。
结果:咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑、地高辛及内标洋地黄用于定量分析的离子反应m/z分别为325.9、341.9、798.0和782.0,生成的主要碎片离子m/z分别为244.1、168.1、651.0和635.0。血浆中咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑线性范围均为2~400ng/mL;地高辛线性范围为0.5~100 ng/mL;分析方法的定量下限咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑为2 ng/mL,地高辛为0.5 ng/mL。以质控样品计算该分析方法的批内、批间精密度RSD均在±15%范围内;生物样品中咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑、地高辛的提取回收率分别在86.8%~93.3%、84.6%~86.4%、81.7%~85.1%范围内。各项稳定性考察结果表明咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑和地高辛在常规实验条件下稳定。
二)、评价体内细胞色素P4503A和P-糖蛋白活性模型的验证
目的:在整体动物水平阐明咪达唑仑和地高辛两种探针联合给药无相互串扰作用,从而建立一种在动物体内同时评价CYP3A和P-gp活性的模型。
方法:雄性SD大鼠随机分组后,每组大鼠分别灌胃给予地高辛混悬液(0.25mg/kg),或者灌胃给予咪达唑仑混悬液(15 mg/kg),或者灌胃给予咪达唑仑混悬液(15 mg/kg),30分钟后再灌胃给予地高辛混悬液(0.25 mg/kg),或者同时灌胃给予咪达唑仑混悬液(15 mg/kg)和地高辛混悬液(0.25 mg/kg)。采用LC-MS/MS法测定咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑和地高辛的血浆浓度。用非房室模型法计算各主要药代动力学参数,并进行统计分析。
结论:本部分研究建立并确证了同时检测生物样品中咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑和地高辛的简单、灵敏、可靠的LC-MS/MS方法,能满足两种探针药物的药代动力学研究的要求。在整体动物水平考察咪达唑仑和地高辛药代动力学特征,阐明咪达唑仑和地高辛联合给药无相互串扰作用,从而建立和验证了一种在动物体内同时评价CYP3A和P-gp活性的模型。
四、五酯片对细胞色素P4503A和P-糖蛋白活性的影响
目的:利用第三部分在动物体内已经建立的同时评价CYP3A和P-gp活性的模型来研究五酯片对咪达唑仑、地高辛药代动力学的影响,获得五酯片影响CYP3A和P-gp活性的直接证据。
方法:雄性SD大鼠随机分成组后,分别灌胃给予蒸馏水、五酯片(0.25 g/kg),再灌胃给予咪达唑仑混悬液(15 mg/kg),30分钟后再灌胃给予地高辛混悬液(0.25 mg/kg)。于给前(0 h)、给药(咪达唑仑)后0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12 h从右颈静脉取血约0.25 mL。用非房室模型法计算各主要药代动力学参数,并进行统计分析。
结果:与单独服用咪达唑和地高辛仑组相比,五酯片使口服咪达唑仑及地高辛的血药浓度升高,使咪达唑仑AUC0-4h升高34.5%、Cmax增加13.4%,CL/F从18.5L/h/kg降低至5.8 L/h/kg,使地高辛AUC0-12h升高55.1%、Cmax增加74.9%,CL/F从2.6L/h/kg降低至1.7L/h/kg。与单独服用咪达唑仑和地高辛组相比,五酯片对1-羟基咪达唑仑的血药浓度及主要药代动力学参数没有显著影响。
结论:本部分研究表明,五酯片抑制了CYP3A和P-gp的活性从而使得咪达唑仑和地高辛的血药浓度升高。从而获得五酯片影响CYP3A与P-gp活性的直接证据。
综上所述,五酯片对CYP3A和P-gp底物环孢素A及经典探针药咪达唑仑和地高辛的血药浓度均有影响,但五酯片对降低剂量环孢素A的血药浓度影响更为显著。利用经典的阳性探针药同时评价五酯片对体内CYP3A与P-gp活性影响的实验结果表明,五酯片抑制了CYP3A和P-gp的活性从而使得咪达唑仑和地高辛的血药浓度升高。以上研究结果可获得五酯片影响CYP3A和P-gp活性的直接证据,为临床上五酯片与CYP3A与P-gp底物药物的合理用药提供科学数据。