背景帕金森病(Parkinson disease,PD)是由于中脑黑质多巴胺能神经元(dopaminergic neurons)的进行性缺失造成的以神经退行性病变为主的中枢神经系统疾病。作为神经递质,多巴胺(dopamine,DA)介导黑质-纹状体通路到纹状体尾壳核的信号转导。多巴胺的缺乏导致锥体外系功能失常,从而产生静止性震颤、肌强直、运动障碍等临床症候群。Sonic Hedgehog(Shh)蛋白在胚胎发育过程中,对中脑多巴胺能神经元的分化发挥了重要作用,可促进正在发育的以及分化成熟的胚胎多巴胺能神经元的存活,并对它们有保护作用。研究表明许多胚胎蛋白在细胞受损后表达增强,并可参与组织的修复过程。但是Shh在中脑多巴胺能神经元受损后表达的变化,尚未见相关报道。因此,为了探索Shh蛋白与PD的关系,我们在实验第一阶段,使用6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)制作PD大鼠模型,然后通过免疫荧光组织化学染色的方法(FITC标记多巴胺能神经元,Cy3标记Shh蛋白),观察Shh在受损中脑内的表达,这对进一步研究黑质—纹状体环路的重建具有一定意义。随着人口平均寿命延长和老龄化出现,帕金森病的发病率呈现明显上升趋势,目前治疗帕金森病可以用药物治疗和神经外科的方法。左旋多巴胺等药物的治疗有一定疗效,但长期使用后疗效下降,而且会产生一些副反应。神经外科手术则有一定的风险和创伤。因此,还未发现一种单纯有效的方法或药物能彻底治愈PD患者,寻找新的治疗和预防帕金森病的药物,研究其作用机制及途径已成为了研究热点。胞二磷胆碱(citicoline,CC)被认为是当前最有前途的神经保护剂之一,我们希望通过研究这种药物改善帕金森病大鼠神经功能的作用机制,继而挖掘Shh蛋白在多巴胺能神经元自我修复过程中的作用。胞二磷胆碱不仅是合成卵磷脂的前体(卵磷脂是细胞膜的关键成分,为乙酰胆碱的合成提供胆碱和维生素B复合体),而且胞二磷胆碱能刺激酪氨酸羟化酶的活性和多巴胺的释放,具有良好的安全性,临床上用来治疗脑血管病,尤其是脑卒中,对于治疗认知和行为障碍有一定疗效,近年有报道用于辅助治疗PD,已有较多临床证据予以支持。因此,在本研究的第二阶段,我们通过腹腔注射胞二磷胆碱治疗PD大鼠,一方面观察疗效,另一方面探讨胞二磷胆碱对多巴胺能神经元的保护作用及对Shh蛋白表达变化的影响。第一部分帕金森病大鼠模型的建立目的脑内定点注射6-OHDA制作合格的帕金森病大鼠模型方法1.实验动物:健康成年的SD大鼠,雌雄不分;分为正常对照组、假手术组和PD模型组。2.应用脑立体定位技术,在大鼠右侧纹状体两针道内四点定位注射6-OHDA;3.于第1,2,4,6周,分别行各组大鼠的行为学检测:腹腔注射阿朴吗啡,计算大鼠健侧旋转圈数(旋转圈数>7r/min,被确定为成功的PD大鼠模型)。4.统计学分析:用重复测量数据的方差分析比较大鼠4次测量的旋转圈数之间的统计学差异。数据分析用SPSS13.0统计软件包完成,P<0.05时,差异有统计学意义。结果1.成功的PD大鼠模型经阿朴吗啡诱导,健侧旋转圈数>7r/min,正常组和假手术组皆无旋转行为,模型组10只大鼠均出现旋转行为,其中有6只大鼠旋转圈数>7r/min,并且>210r/30min,被定为成功的PD大鼠模型。球形检验W=0.359,P=0.588,不拒绝球形假设,F=399.319,P<0.001,4次行为学检测结果间差异有显著性意义;成功的PD大鼠模型除第4周和第6周旋转圈数之间差异没有显著性意义外(P=0.057),其余各周之间的差异具有显著性(P<0.001)。2.成功模型鼠还可观察到其他异常行为,如嗅探、觅食、站立、搔耳、洗脸样动作等。第二部分Shh蛋白在帕金森病模型大鼠黑质的上调表达目的检测Shh蛋白在PD模型大鼠中脑黑质表达的变化。方法1.行正常组、假手术组和PD模型组大鼠的灌注固定;2.制作大鼠中脑组织冰冻切片;3.免疫荧光双标组织化学术检测大鼠中脑冰冻切片组织内Shh及酪氨酸羟化酶(TH)的表达;4.激光共聚焦显微镜术观察黑质内Shh及TH的免疫荧光双重染色结果;5.Leica Confocal Software对各组大鼠中脑Shh蛋白荧光进行定量分析,记录荧光值;6.统计学分析:SPSS13.0统计软件包单向方差分析对各组大鼠中脑Shh荧光定量所得数据进行统计分析,P<0.05为显著统计学差异水平。结果1.正常对照组中,TH阳性细胞和阳性纤维数量较多,胞体形态较饱满,细胞突起丰富,假手术组TH阳性细胞数,细胞及神经纤维的形态与正常对照组的相似,且两组均看不到特异性Shh的染色;模型组中,TH阳性细胞和神经纤维数量显著减少,细胞较小并且形态不饱满,可见明显的Shh染色,并且两种荧光存在共定位现象。2.三组红色荧光值的方差不齐,F=353.528,P<0.001,故采用Welch法分别对各指标作进一步方差分析,F=180.575,P<0.001,组间均数具有显著性差异。其中,正常对照组与假手术组相比较:正常对照组红色荧光值为366.65±48.54,假手术组红色荧光值为368.55±48.62,两者差异没有显著性(P=0.998,P>0.05);模型组红色荧光值为1484.42±318.00,分别与正常对照组和假手术组比较,均具有显著性差异(P<0.001),说明Shh蛋白在PD模型大鼠黑质中表达上调。结论在PD模型组大鼠中,黑质Shh蛋白表达上调,提示Shh在PD模型大鼠中脑多巴胺能神经元的自我修复过程中可能发挥着一定的作用。第三部分胞二磷胆碱对多巴胺能神经元的保护作用及其与Shh蛋白表达的关系目的探讨胞二磷胆碱对多巴胺能神经元的保护作用及其对Shh蛋白表达变化的影响。方法1.SD大鼠30只,随机均分为3组:假手术组(在大鼠右侧纹状体两针道内四点定位注射含0.2g/L抗坏血酸的生理盐水4μl,术后第21天开始,腹腔内注射5%的葡萄糖溶液,每天一次,分别连续注射治疗20天)。单纯模型组(在大鼠右侧纹状体两针道内四点定位注射6-OHDA术后第21天开始,腹腔内注射5%的葡萄糖溶液,每天一次,分别连续注射治疗20天)和胞二磷胆碱治疗组(在大鼠右侧纹状体两针道内四点定位注射6-OHDA后第21天开始,腹腔内注射胞二磷胆碱溶液,每天一次,分别连续注射治疗20天)。2.3组大鼠饲养环境相同,于注射治疗结束后行心脏灌注,4%多聚甲醛内固定后,取脑。3.常规制作冰冻脑切片,片厚35μm,用12孔板保存于0.02M的PBS溶液中。4.将脑片分成A、B组,A组脑片行Sonic Hedgehog-TH免疫荧光双重染色,B组脑片行Shh抗体的DAB染色。5.统计学分析:用SPSS13.0统计软件包单向方差分析对三组大鼠损毁侧与健侧TH阳性细胞数的比率进行统计分析;用独立样本t检验对单纯模型组与治疗组损毁侧黑质的Shh阳性细胞数进行统计分析。P<0.05为显著统计学差异水平。结果1.Shh-TH免疫荧光双重染色结果显示:治疗组损毁侧黑质TH阳性神经元数目较单纯模型组的显著增多。3组大鼠损毁侧与健侧TH阳性细胞数的比率方差不齐,F=5.058,P=0.014,P<0.05,故采用Welch法分别对各指标作方差分析,F=508.826,P<0.001,组间均数具有显著差异。其中,假手术组比率为1.02±0.09,单纯模型组为0.10±0.02,治疗组为0.31±0.06,3组比率之间均具有显著性差异,P<0.001。两组大鼠损毁侧黑质可见Shh的阳性表达。2.Shh抗体的DAB染色结果显示:单纯模型组与治疗组损毁侧黑质有棕黄色Shh阳性细胞出现;治疗组Shh阳性细胞数更多,细胞更大。两组大鼠损毁侧黑质Shh阳性细胞数总体方差齐,F=3.276,P=0.087,P>0.05,方差齐同条件下,t=10.534,P<0.001,故差异有显著性意义。阴性对照组双侧黑质区均未发现阳性显色细胞。结论1.在6-OHDA制作的PD模型大鼠中,胞二磷胆碱的使用可保护TH阳性细胞。2.胞二磷胆碱的神经保护作用可能与Shh蛋白相关,胞二磷胆碱可能通过Shh蛋白的表达上调而启动其神经保护的作用机制。